TaqMan Pri-miRNA Assays：檢測(cè)MicroRNA表達(dá)的起源
【摘要】 初級(jí)microRNA（pri-miRNA）是長(zhǎng)鏈非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本，至少有一個(gè)（更常見(jiàn)的是多個(gè)）約65 nt莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體microRNA（pre-miRNA），這些前體microRNA中含有成熟的microRNA（miRNA）序列。TaqMan Pri-miRNA Assays讓這種新“基因”種類的轉(zhuǎn)錄能夠輕松方便地定量，其靈敏度和特異性足夠分辨多個(gè)miRNA位點(diǎn)。
初級(jí)microRNA（pri-miRNA）是長(zhǎng)鏈非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本，至少有一個(gè)（更常見(jiàn)的是多個(gè)）約65 nt莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體microRNA（pre-miRNA），這些前體microRNA中含有成熟的microRNA（miRNA）序列（圖1）。pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本的切割最終導(dǎo)致具生物活性的成熟miRNA的釋放，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)信使RNA靶點(diǎn)的降解，或更常見(jiàn)的是翻譯阻遏。
分析設(shè)計(jì)與選擇
所有的TaqMan? Pri-miRNA Assays都是利用Applied Biosystems最新的TaqMan? 分析設(shè)計(jì)算法來(lái)設(shè)計(jì)的，此算法帶來(lái)了金標(biāo)準(zhǔn)的分析性能和數(shù)據(jù)質(zhì)量。由于pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本還未詳盡地定位，所以分析在設(shè)計(jì)時(shí)很接近Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中每個(gè)莖環(huán)序列，確保對(duì)含有目的成熟miRNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。此方法的額外優(yōu)勢(shì)是，每個(gè)公開(kāi)的莖環(huán)都有一個(gè)配對(duì)的TaqMan? Pri-miRNA Assay和TaqMan? MicroRNA Assay，讓miRNA成熟途徑中任一階段的RNA序列都能獨(dú)立地定量。
設(shè)計(jì)過(guò)程一開(kāi)始將莖環(huán)序列定位到最新版本的人、小鼠和大鼠基因組中。接下來(lái)，在莖環(huán)結(jié)構(gòu)任一側(cè)緊挨著的500個(gè)堿基對(duì)的區(qū)域都作為設(shè)計(jì)對(duì)象，并選擇出得分最高的分析（圖2）。不定位在單個(gè)染色體坐標(biāo)的分析會(huì)嚴(yán)重扣分，幫助確保最終精選的分析測(cè)定了單個(gè)基因組位置的轉(zhuǎn)錄。
來(lái)自Sanger miRBase的莖環(huán)序列與基因組比對(duì)。在莖環(huán)任一側(cè)延伸500個(gè)堿基對(duì)的側(cè)翼序列作為分析設(shè)計(jì)的對(duì)象。
為了方便起見(jiàn)，TaqMan? Pri-miRNA Assays和TaqMan? MicroRNA Assays都能用相同的在線界面來(lái)平行識(shí)別、選擇和購(gòu)買。利用新的比對(duì)定位瀏覽器可簡(jiǎn)化對(duì)兩種分析類型之間的空間關(guān)系的了解（圖3）。
TaqMan? Pri-miRNA Assays和TaqMan? MicroRNA Assays的位置共同顯示在莖環(huán)序列（綠色空心框）和成熟miRNA序列（綠色實(shí)心框）的背景下，讓每個(gè)分析在初級(jí)轉(zhuǎn)錄本上的空間關(guān)系能很容易地理解。更多的分析細(xì)節(jié)顯示在右側(cè)。灰色區(qū)域代表了作為分析設(shè)計(jì)對(duì)象的區(qū)域。
應(yīng)用
TaqMan? Pri-miRNA Assays讓這種新“基因”種類的轉(zhuǎn)錄能夠輕松方便地定量，其靈敏度和特異性足夠分辨多個(gè)miRNA位點(diǎn)。這對(duì)于解決下列miRNA表達(dá)和功能性方面的關(guān)鍵問(wèn)題非常理想：
? miRNA“基因”轉(zhuǎn)錄的調(diào)控
11%的成熟miRNA序列產(chǎn)生自多個(gè)基因組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄。也就是說(shuō)，成熟miRNA序列來(lái)自多個(gè)莖環(huán)，即多個(gè)pri-miRNA序列。通過(guò)利用特異針對(duì)各個(gè)pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本的TaqMan? Pri-miRNA Assays，能將轉(zhuǎn)錄改變與目的miRNA在成熟水平所檢測(cè)到的變化直接關(guān)聯(lián)。
? miRNA生物發(fā)生的調(diào)控
最近的觀察數(shù)據(jù)表明，成熟途徑的多個(gè)步驟都受到調(diào)控（Heo，2008；Viswanathan，2008）。在闡明這些調(diào)控事件何時(shí)是成熟miRNA水平所檢測(cè)到變化的成因時(shí)，關(guān)鍵要排除初級(jí)轉(zhuǎn)錄本在基因水平的的轉(zhuǎn)錄變化。TaqMan? Pri-miRNA Assays是定量目前成熟途徑中初級(jí)轉(zhuǎn)錄本集合的理想工具，與特異針對(duì)成熟miRNA的TaqMan? MicroRNA Assays共同使用，能夠識(shí)別并鑒定出在成熟途徑水平上所發(fā)生的調(diào)控事件。
? Pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本的定位
MicroRNA基因座一般是多順?lè)醋拥模渲型粋€(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本中多個(gè)miRNA序列聚集成簇。然而，許多pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本的一級(jí)結(jié)構(gòu)還未充分鑒定。利用獨(dú)特的設(shè)計(jì)方法，多個(gè)TaqMan? Pri-miRNA Assays之間的關(guān)聯(lián)度能夠成為一種獨(dú)特快速的方法，來(lái)定位miRNA莖環(huán)簇。
分析性能
TaqMan? Pri-miRNA Assays帶來(lái)了Applied Biosystem? TaqMan?分析所聞名的高靈敏度、極佳特異性和寬的線性動(dòng)態(tài)范圍。由于分析靈敏度高，TaqMan? Pri-miRNA Assays只需要極少的樣品投入：低至1 ng的總RNA已足夠定量中等至高表達(dá)miRNA位點(diǎn)的表達(dá)。
與miRNA研究領(lǐng)域的頂尖研究人員合作，我們展示了分析在分辨包含密切相關(guān)的miRNA莖環(huán)序列的不同基因座上的能力（圖4）。這對(duì)于它們?cè)谘芯炕蛘{(diào)控這個(gè)重要方面的應(yīng)用很關(guān)鍵。
利用含有pri-miRNA莖環(huán)mir-26a-1或mir-26a-2（它們共享同一個(gè)成熟hsa-miR-26a序列）的質(zhì)粒，pri-mir-26a-2 TaqMan? Pri-miRNA Assay只檢測(cè)hsa-mir-26a-2質(zhì)粒的特異性得到證實(shí)。（由韓國(guó)首爾國(guó)立大學(xué)的Young-Kook-Kim 和Narry Kim提供。）
流程
TaqMan? Pri-miRNA Assays采用了與所有Applied Biosystems? TaqMan? Gene Expression Assays相同的簡(jiǎn)單方便流程。無(wú)論是兩步法實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）步驟的可靠性，一步法RT-qPCR步驟的便利性，還是快速循環(huán)的速度，Applied Biosystems都提供了經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的試劑盒，支持這些不同的分析流程。在定量前必須確保樣品是不含DNA的，這一點(diǎn)很重要，因此分析經(jīng)過(guò)了額外的驗(yàn)證，利用Ambion? TURBO DNA-free? Kit來(lái)進(jìn)行樣品的預(yù)先純化。
介于TaqMan? Gene Expression Assays和TaqMan? Pri-miRNA Assays共享相同的設(shè)計(jì)方法和實(shí)驗(yàn)流程，同樣多種選擇的TaqMan? Gene Expression Assays的內(nèi)源對(duì)照分析也推薦與TaqMan? Pri-miRNA Assays共同使用。
? 高度特異——單個(gè)基因組位點(diǎn)的定量microRNA轉(zhuǎn)錄
? 快速、簡(jiǎn)單，可擴(kuò)展——兩步法RT-qPCR提供了高質(zhì)量的結(jié)果
? 新視角——在基因水平測(cè)定microRNA的表達(dá)
