小RNA與蛋白質的相互作用

劉默芳*，王恩多

(中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，分子生物學國家重點實驗室，上海200031)

摘　要：小分子調控RNA，包括siRNA (small interfering RNA)、miRNA (microRNA)和piRNA (piwi interacting RNA)、hsRNA (heterochromatin associated small RNA)等，是當前生命科學研究的前沿熱點。越來越多的證據表明，這些小分子RNA 存在于幾乎所有較高等的真核生物細胞中，對生物體具有非常重要的調控功能。它們通過各種序列特異性的RNA 基因沉默作用，包括RNA 干擾 (RNAi)、翻譯抑制、異染色質形成等，調控諸如生長發育、應激反應、沉默轉座子等各種各樣的細胞進程。隨著對這些小分子調控RNA 的發現，一些RNase III 酶家族成員、Argonaute 蛋白質家族成員及RNA 結合蛋白質等先后被鑒定為小RNA 的胞內蛋白質合作者，參與小RNA 的加工成熟和在細胞內行使功能。本綜述簡介一些RNA 沉默作用途徑中重要組分的結構和功能的研究進展。

關鍵詞：小分子調控RNA；RNA 基因沉默；Drosha；Dicer；Argonaute；Piwi；小RNA 結合蛋白

中圖分類號：Q522;Q51　　文獻標識碼：A

生命科學 Chinese Bulletin of Life Sciences 第20 卷 第2 期 2008 年4 月

Small RNAs and proteins in RNA silencing pathways
LIU Mo-fang*, WANG En-duo
(State Key Laboratory of Molecular Biology, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China)
Abstract: Small regulatory RNAs, including siRNA (short interfering RNA), miRNA (microRNA), piRNA (piwi interacting RNA), and hsRNA (heterochromatin associated small RNA), have been the hot frontier of life sciences in the past few years, and it is becoming more and more apparent that these small molecules have key regulatory functions. Small RNAs trigger various forms of sequence specific gene silencing, commonly referred to as RNA silencing, such as RNA interference (RNAi), translational repression, and heterochromatin formation in all higher eukaryotes and play important roles in cellular processes as diverse as development, stress response, or transposon silencing. Soon after the discovery of small regulatory RNAs, members of the RNase III family and Argonaute protein family, some RNA binding proteins, and etc., were identified as their major cellular protein interactors and involved in the biogenesis and various cellular functions of small RNAs. This review summaries the understanding of the structures and functions of the important components in small RNA-induced gene-silencing pathways.
Key words: small regulatory RNA; RNA gene silencing; Drosha; Dicer; Argonaute; Piwi; small RNA binding protein

在真核生物中，小分子非編碼RNA 引發一系列序列特異性的基因表達負調控作用，包括RNA干擾(RNAi)、翻譯抑制和異染色質形成等，這一現象被稱為RNA 基因沉默作用[1-3]。RNA 沉默作用的發揮離不開參與小RNA生成和作用的一系列蛋白質因子。在過去的幾年中，通過對這些小RNA 相互作用蛋白質的結構和功能的研究，對小RNA生成和作用的分子機制、生物學功能等方面的研究都取得了諸多突破性的進展。

1　siRNA/miRNA作用途徑中的蛋白質因子
siRNA和miRNA是最早被發現和認識的小分子調控RNA。它們有許多共同之處，如：大小都約為22 nt；都經過RNase III 家族酶加工成熟；都是在轉錄后水平負調控基因表達；作用途徑共享多種蛋白質因子。兩者主要的區別在于起源上： miRNA 是內源性的，從編碼miRNA 的基因轉錄長鏈初始miRNA (pri-miRNA)，分別在核內和胞漿經兩步加工形成；siRNA 則是從內源或外源的dsRNA 前體中生成，在胞漿內加工成熟，不需要Drosha 等細胞核內因子參與。此外，siRNA引發mRNA的降解，而動物miRNA 主要抑制mRNA 的翻譯。

1.1　Drosha 及其輔助蛋白質　Drosha 負責pr imiRNA核內加工，屬于RNase III 家族第II 亞家族中的一種酶，其特征是C- 端有2 個RIII 結構域和1個dsRNA 結合結構域(double strands RNA binding domain，dsRBD)，N- 端帶有一長肽段[4]。人Drosha含有1 374 個氨基酸殘基，N- 端有2 個可能參與蛋白質- 蛋白質相互作用的結構域，分別是脯氨酸富集區和絲氨酸- 精氨酸富集結構域，后者在參與RNA代謝和剪接的蛋白質因子中普遍存在[5,6]。除了加工pri-miRNA 外，人Drosha 與E.coli RNase III相似，也參與加工高級結構化的rRNA 前體[5]。

在哺乳動物中僅有Drosha 不能將長pri-miRNA加工成70 nt 左右的前體miRNA (pre-miRNA)形式，還必需有dsRNA 結合蛋白DGCR8 參與才能進行該反應， DGCR8 在DiGeorge綜合征(一種致命性先天病癥，其特征是無胸腺、甲狀旁腺功能減退和心臟缺陷)中缺失，其果蠅同源物被稱為Pasha[7,8]。此外，還有多種RNA 結合蛋白，包括RNA 解旋酶、dsRNA 結合蛋白、Ewing 肉瘤家族蛋白及一些核蛋白等，可能參與調節pri-miRNA 的核內加工[7]。生成的pre-miRNA由核膜上的Exportin-5轉運蛋白，轉運到胞漿中，進一步被Dicer 酶加工[9]。Exportin-5同時還介導tRNA、腺病毒VA1 等非編碼RNA的核輸出[ 10 ]。

1.2　Dicer 及其輔助蛋白質　siRNA/miRNA 的成熟是RNase III家族第III亞家族酶――Dicer加工完成[11]。哺乳動物Dicer 是一個相對分子質量約200 000 的多結構域蛋白質[12,13]，通常含有6 個結構域，它們是：1 個RNA 解旋酶―― DEXH 盒子、1 個含結合dsRNA 折疊的DUF283、1 個結合dsRNA 末端的PAZ、2 個RIII 和1 個dsRNA 結合結構域。

PAZ 結構域同時存在于構成RNA 沉默復合物的Argonaute (Ago)蛋白質家族中，事實上，PAZ 就取名于3 個主要的Ago 蛋白質，即Piwi、Ago 和Zwille[12]。賈第蟲Dicer 僅有1 個PAZ、2 個RIII 結構域[13]，比哺乳動物Dicer 要小得多，但在體外卻有正常的裁剪活性。對賈第蟲Dicer 晶體結構的研究揭示了 Dicer 制造確定長度小RNA的機制：Dicer 的晶體結構外形象短柄斧，2 個RIII 結構域構成刃部，PAZ 結構域構成柄端，之間通過長α 螺旋相連，相距約65%26Aring;，相當于25nt RNA 的長度[13]。

大多數脊椎動物、尾索動物和蠕蟲類動物都只有1 個Dicer，而昆蟲、真菌和植物往往有多個Dicer 同系物[14]。例如，果蠅中有2 個Dicer：Dcr-1 和 Dcr-2，分別負責miRNA 和siRNA 的生成[15]。除了加工生成小RNA外，Dicer 在RNA沉默復合物的裝配中也發揮作用，雙鏈siRNA 不能在去掉Dicer 的人細胞系中引發RNAi[16]，證據表明，人Dicer 與已知的8 個人Ago 家族蛋白都有直接的相互作用[14]。

一些dsRNA 結合蛋白與Dicer 偶聯，促進 miRNA 的加工或沉默復合物的裝配。Loqs 是果蠅 Dcr-1 生成miRNA 的輔助蛋白質因子[17,18]。重組Dcr-1 能夠獨立將pre-miRNA 加工成miRNA，但Loqs 能大大提高Dcr -1 對dsRNA 的親和力[17]。另一個 dsRNA 結合蛋白R2D2，與果蠅Dcr-2 相互作用，促進siRNA 裝配到Ago2[19]。Dcr-2 與R2D2 組成的異源二聚體能夠根據雙鏈siRNA末端的熱穩定性選擇向導鏈[20]。TRBP 是Loqs 的人源同系物，它同時與Dicer 和Ago2 相互作用，不僅影響miRNA 的加工，而且與Dicer 一起構成沉默復合物的裝配平臺[21]。另一個人源Loqs-PACT，類似于TRBP，雖然不是pre-miRNA 加工必需的，但強烈地影響胞內成熟miRNA的積累和siRNA引發RNAi的效率[22,23]。

1.3　siRNA/miRNA 沉默復合物中的蛋白質因子　siRNA 和miRNA 都是通過RNA 誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)負調控基因表達[24]。它們通過堿基配對，引導RISC 結合到靶mRNA 上，siRNA 指導RISC 執行定點裁剪，引發靶mRNA 的降解，而大多數動物miRNA 不直接導致靶mRNA 的剪切，主要是抑制翻譯，或者介導mRNA 的衰變，如mRNA 3' 去腺苷化、5' 脫帽，間接影響mRNA 的穩定性[25]。

RISC 是一個由多種蛋白質組成的大分子復合物，其核心成分是Ago 家族蛋白質，最小的RISC 僅有Ago2 一個蛋白質成分[26]。Ago 蛋白質種類繁多，共同點是都有1 個PAZ 結構域、1 個具有潛在RNaseH 核酸內切酶活性的PIWI 結構域[24,27]。大多數真核生物都有多種Ago 家族成員，不同的Ago 通常具有不同的功能[2,24,27,28]。例如，果蠅有5 個不同的 Ago 家族成員：Ago1、Ago2、Aub、Piwi 和Ago3； Ago1 與miRNA 偶聯，而Ago2 與siRNA偶聯，Ago1 和Ago2 組成Ago 亞家族 [29,30]; Aub、Piwi 和Ago3 屬于Ago 家族的PIWI 亞家族，與piRNA 偶聯。

RISC 還含有其他一些蛋白質組分，包括Vasa 內含子基因蛋白質(VIG)、脆弱X 蛋白的果蠅同源物(DmFXR)、Tudor-SN、潛在的RNA 解旋酶 Dmp68 及Gemin3 等[31]。這些蛋白質成分不是RISC 核酸酶活性必需的，可能具有其他作用，如RISC 周轉、RISC 亞細胞定位等，它們在RNAi 機器中的準確功能還有待于進一步的研究。此外，Ago 的兩個輔助蛋白：MOV10 和含有RNA識別模塊RRM 的蛋白TNRC6B/KIAA1093，它們與Ago 蛋白共定位于參與mRNA降解的胞漿P小體，介導miRNA誘導的mRNA 衰變[31]。

2　piRNA作用途徑中的蛋白質因子
最近在生殖系細胞中發現了一類新的小RNA，因它們特異性地與Ago家族的PIWI亞家族蛋白質相互作用，被命名為piwi-RNA，簡稱piRNA[32-36]。

piRNA與siRNA/miRNA有許多不同之處：

(1) piRNA 與PIWI 亞家族蛋白質相互作用，而siRNA/miRNA 與Ago亞家族蛋白質相互作用；

(2) siRNA/miRNA的生物合成必需RNase III 家族酶，而piRNA 的生物合成可能需要PIWI亞家族蛋白質[37-39];

(3) piRNA長度為24 － 31nt，稍長于22 nt 的miRNA/siRNA；

(4) piRNA 有超過50 000 種，而miRNA 只有數百種；

(5) 大多數piRNA序列起源于基因組上20－90 kb長度的DNA鏈，每條DNA鏈可能代表一個長的piRNA 前體，常見DNA 雙鏈被雙向不重疊的轉錄，生成 2 個piRNA長鏈前體，而siRNA和miRNA分別從雙鏈和短發夾結構RNA前體衍生[40-44]; (6) 除了基因沉默的負調控效應外，部分piRNA可能還有正調控效應，如增加mRNA 的穩定性和翻譯[42]。

2.1　PIWI亞家族蛋白質與piRNA的生成　piRNA是怎樣生成的？證據表明，piRNA 的生成與Dicer 無關[34]。它們可能是由某種核酸內切酶從長的單鏈RNA前體加工生成。推測果蠅的Piwi、Aub 和Ago3可能就是這樣的核酸內切酶，因為它們具有剪切RNA 的活性[37-39]。

從轉座子衍生的piRNA 可能通過一種“乒乓”機制生成[38,39]。比較果蠅的Ago3-piRNA、AubpiRNA和Piwi-piRNA序列發現：Aub-piRNA和PiwipiRNA主要來自轉座子DNA反義鏈，而Ago3-piRNA 主要來自正義鏈；許多Ago3-piRNA 5' 端的10 nt 序列與Aub- 或Piwi-piRNA的5' 端10 nt 序列正好互補配對，Aub-piRNA和Piwi-piRNA的5'末端堿基偏愛 U，而Ago3-piRNA 的第10 位堿基偏愛A。

由此推測，P IWI 亞家族蛋白質可能也有類似Ago2 的 RNaseH 活性，受向導piRNA 的指導，在對應于 piRNA 5' 的第10 和11 位核苷酸剪切靶RNA鏈，產生一個新piRNA的5' 端序列，也就是，Ago3-piRNA 復合物切割靶RNA產生Aub-piRNA和Piwi-piRNA的 5' 端，而Aub-piRNA 或Piwi-piRNA 復合物切割靶 RNA 產生Ago3-piRNA 的5' 端。這個過程不僅連續制造新的piRNA，還不斷破壞從自在基因轉錄的靶 RNA。哺乳動物和魚的piRNA可能也通過類似的機制生成[41,43].

此外，不同于動物的miRNA和siRNA，piRNA 的3' 末端抗NaIO4/β- 消除處理，表明其核糖2'- 羥基被甲基化修飾[32,38,43-45]。最近，從果蠅中鑒定了一個負責piRNA 3' 末端甲基化修飾的甲基化酶―― Pimet，與從擬南芥獲得的植物miRNA 3' 末端甲基化酶HEN1 同源[46]。目前還不清楚這種修飾的意義，推測可能對piRNA 的穩定性及功能至關重要。

2.2　piRNA的生物學功能　piRNA的生物學功能是什么？目前對這個問題還知之甚少，但它們的表達特異性、基因組分布特性為預測其生物學功能提供了重要線索。piRNA 在生殖系細胞中特異表達，大部分piRNA 序列分布于基因組的特定位點，如 17%－20%的哺乳動物piRNA起源于基因組的重復區，包括轉座子和逆轉座子，提示piRNA 可能通過沉默基因組內源的自在性遺傳元件(selfish genetic elements)，如逆轉錄病毒和重復性序列等，保證生殖系細胞基因組的穩定性，在配子形成(精子和卵子發生)過程中發揮作用[32-35,40]。事實上，已發現果蠅的一種轉座因子――吉普賽因子(gypsy)piRNA 下調吉普賽因子內源逆轉錄病毒的正義鏈轉錄本，專一性地在生殖系細胞中防止自在性DNA 的有害表達[ 47 ] 。

piRNA偶聯蛋白質的已知功能也是預測其功能的重要線索。Piwi 和Aub 是表觀遺傳學調控因子，參與異染色質形成[48];Piwi 與PcG (Polycomb group) 蛋白質共結合于基因組PcG 應答元件上，調控PcG 靶染色質的核內組織，協助PcG沉默同源異型基因[49]。在果蠅雄性生殖細胞系中，Piwi 防止逆轉座子轉位[50]。而Piwi 的鼠同源物Miwi，可增加靶mRNA 的穩定性，可能對翻譯有促進作用[42]。協同于這些蛋白質的功能，piRNA 可能參與表觀遺傳學調控、基因轉位抑制、轉錄后調控等。

總之，piRNA的發現揭示了生殖系細胞中一類新層面的基因表達調控，對其生成及作用機制、生物學功能的研究將加深我們對精子和卵子形成過程的了解。

3　小RNA與異染色質的形成
小RNA對著絲粒異染色質的形成和維持至關重要[51]。在裂殖酵母、植物和果蠅的細胞核內都發現了一種類似miRNA 的小分子RNA，它們與異染色質的形成密切相關，被命名為異染色質相關小RNA (heterochromatin associated small RNAs，hsRNA)[52]。它們通過RNA誘導基因轉錄起始沉默復合物(RNAinduced initiation of transcriptional gene silencing， RITS)，參與組蛋白甲基化修飾，促成異染色質形成，在轉錄水平關閉基因表達。RITS 復合物由 Ago1、染色質結構域蛋白Chp1 及Tas3 等蛋白質組成，Tas3 結合活性基因ura4+ 轉錄的RNA，沉默 ura4+ 表達，起始異染色質形成 [52,53]。

在裂殖酵母中建立了RITS 作用模型[27,52-55]: hsRNA指導RITS復合物將依賴RNA的RNA聚合酶 ( R dRP) 招募到新轉錄的RNA 上，將其轉化成 dsRNA。裂殖酵母的Dicer ―― Dcr1，與RdRP 復合物發生直接偶聯，將新生成的dsRNA裁剪為與轉錄位點互補的小RNA[56]。這些新生成的小RNA 裝配到RITS 中，引發新轉錄RNA 的降解，同時指導沉默因子Rik1招募組蛋白甲基轉移酶Clr4到染色體的特定位點，接著Clr4 促使H3(histone-3)的K9 甲基化，這一修飾為克羅莫結構域蛋白質，如Swi6、 Chp1 和Chp2 (HP1 相關蛋白)等創造結合位點，招募更多其他蛋白質，從而啟動異染色質形成，使基因沉默進一步擴大。

在異染色質重復區，位于啟動子下游的基因被沉默的效率要高于位于上游的基因，說明轉錄促進沉默作用[54,55]。在裂殖酵母中，RNAi 通路為異染色質型沉默插入著絲粒重復區的轉基因所必需。證據表明，在著絲粒重復區位點插入的轉基因，從中轉錄生成的RNA可直接被RNAi 加工成siRNA，進而參與轉基因的異染色質沉默[57]。

4　展望
具有調控功能的小RNA 通過轉錄后水平、轉錄水平、表觀遺傳學水平和異染色質形成等方式調控基因組的表達，參與多種細胞過程，對個體生長發育、繁殖和遺傳起至關重要的作用。

通過對小RNA及其相互作用蛋白質的研究，使我們對這類新調控子的生成和作用機制、生物學功能等都有了一定的認識，但對一些新發現的小RNA，如piRNA，還需要進一步研究其生成及作用模式，如：哪些蛋白質參與piRNA 3' 端形成？新生成的piRNA是如何裝載到PIWI蛋白中的？

此外，尚需鑒定包括miRNA 和piRNA 在內的大部分小RNA 的生物學功能。另外，調控小RNA 的表達表現出高度的時空性，對模式生物的一些特定發育、生理或病理狀態的研究，是否還會發現新類型的小RNA？通過生化和分子生物學進一步研究將逐漸解決這些問題。

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