果酒增香釀造技術研究取得新進展

近日，陜西師范大學通過剖析釀酒微生物、酶及發酵前冷浸漬等工藝處理對果酒香氣化合物生成的影響，闡明主要香氣化合物的生成機理，并探討優良產香酵母選育的研究進展。最后，對未來果酒風味的研究方向進行展望，旨在為果酒增香釀造技術的創制提供一定理論支持。

1 果酒香氣

香氣是果酒最重要的感官品質指標。果酒中發現的香氣物質超過1 000 種，主要是在微生物生長代謝過程中形成，其產生機制如圖1所示。來源于水果的品種香是果酒香氣的重要組成部分，有利于果酒典型風味的塑造，然而大多品種香氣化合物在釀酒及貯藏過程中會發生一系列變化，果香特征減弱；乙醇發酵過程產生的發酵香氣構成了果酒香氣的基本骨架，對果酒最終風味形成具有決定作用；陳釀過程中品種香氣與發酵香氣進一步轉化，使果酒整體香氣更加平衡和諧。

1.1 果酒香氣形成機制

在發酵過程中，以糖苷結合態形式存在于水果中的非揮發性香氣前體物質在釀酒酵母相關酶的作用下解離出游離態香氣，主要包括一些硫醇類和萜烯類化合物，這些物質貢獻了果酒主要的品種香氣，賦予果酒獨特的風味。總體來說，果酒芳香大部分由發酵香氣組成，構成了果酒香氣的主體部分，香氣化合物包括酯類、醇類、有機酸類、醛酮類、含硫化合物以及萜烯類等。

陳釀過程中果酒的芳香成分遷移轉化，進一步提升了果酒的香氣復雜性。關于果酒的陳釀增香機理，一般認為與氧有關：一是“氧化說”，如葡萄酒陳釀期間氧氣通過橡木桶的微孔進入酒液，使醇、醛類物質緩慢氧化，高級醇類含量降低；二是“酯化說”，即醇類物質氧化成相應的酸，酸與乙醇反應形成酯，使酯香增強。陳釀香氣會隨陳釀周期的變化呈現不同的結果。

1.2 主要風味化合物的合成及調控機理

高級醇類和酯類物質是發酵香氣的重要組成部分，幾乎存在于所有發酵果酒中。

1.2.1 高級醇類物質

高級醇類物質主要由酵母在α-酮酸發酵過程中形成，與Ehrlich途徑降解氨基酸有關。高含量的高級醇會產生威士忌等異味，而低含量的高級醇則會賦予酒青草香、果香等香氣?？梢酝ㄟ^調節Ehrlich途徑調控高級醇的生成。酵母生長階段、相關酶活力和氨基酸含量等因素均會影響Ehrlich途徑的代謝過程，從而影響果酒香氣成分組成。

1.2.2 酯類物質

酯類物質是在果酒中發現的最豐富的香氣化合物，包括乙酸酯和乙酯兩類，它們由酵母通過不同的代謝機制形成，但均具有類似水果的芳香，如草莓、甜果、青蘋果、香蕉等氣味。乙酸酯的形成依賴于乙酸和高級醇，也受釀酒酵母中ATF基因編碼的兩種醇乙酰轉移酶的影響。

2 果酒增香發酵

2.1 釀酒微生物對香氣的影響

2.1.1 酵母對香氣的影響

產香酵母又稱產酯酵母，是一類能夠改善發酵產品風味的酵母。產香酵母能分泌豐富的糖苷酶類，在代謝過程中產生大量酯類、醇類等香氣物質，使酒體協調，賦予酒體濃郁的發酵香味。果酒中常見的產香酵母包括克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、鐵紅假絲酵母（Candida pulcherrima）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）等。

1 ）克魯維畢赤酵母

克魯維畢赤酵母具有很強的產酯能力，特別是乙酸苯乙酯和辛酸乙酯，能夠賦予酒類特色的果味、玫瑰味、甜味和蜂蜜味。如由克魯維畢赤酵母發酵的蘋果酒具有濃郁的熱帶水果味。

2 ）葡萄汁有孢漢遜酵母

葡萄汁有孢漢遜酵母的主要特征之一是高產乙酸酯。Ciani等檢測到由葡萄汁有孢漢遜酵母發酵的白葡萄酒中乙酸乙酯含量約為釀酒酵母發酵的9 倍。與釀酒酵母相比，用葡萄汁有孢漢遜酵母發酵葡萄酒產生的總脂肪酸含量和總高級醇含量要少得多，這有利于減少酒精味、指甲油味、脂肪味等不良氣味。

3） 其他產香酵母

鐵紅假絲酵母與酒中高含量酯的產生有關。釀酒酵母進行混菌發酵時會產生較高水平的乙酸乙酯以及一些與不良風味有關的揮發性物質，當乙酸乙酯質量濃度為0.2 g/L時，葡萄酒的果味與乙酸乙酯呈強相關。季也蒙有孢漢遜酵母與酒中玫瑰和蜂蜜味有關，而Hanseniaspora vineae是果香椰子和香草味形成的主要原因，此外，Hanseniaspora vineae中支鏈氨基酸轉氨酶（BAT2）和醇酰基轉移酶（EEB1）基因的缺失會導致高級醇、脂肪酸和乙酯產量的減少。

2.1.2 混菌發酵對香氣的影響

目前果酒工業生產采用釀酒酵母單菌發酵，其發酵速率快、效率高，但生產的果酒缺乏風味復雜性。非釀酒酵母雖然發酵性能差，但在發酵過程中可以通過酶和風味代謝產物的產生改善發酵酒的芳香特性。因此，利用釀酒酵母與非釀酒酵母混合發酵提升果酒感官質量是一種可行的辦法。

1） 混菌發酵菌種的選擇

相較于傳統的發酵方式，利用非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵對改善果酒的風味和口感具有積極作用。

2） 接種方式的選擇

在混合發酵過程中，接種策略也會影響酒體香氣特征。研究發現順序接種發酵比同時接種發酵效果更好，因為順序接種時非釀酒酵母在發酵開始階段能進行更高程度的代謝表達。

接種比例也是一個必須要考慮的問題。據報道，以1∶1同時接種釀酒酵母和拜氏接合酵母有利于生產乙酯，包括乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等。然而，當接種比例為1∶100或1∶1 000時會生成過量的乙酸乙酯，產生不良氣味。

2.1.3 蘋果酸-乳酸發酵對香氣的影響

蘋果酸-乳酸發酵是乳酸菌將蘋果酸轉化為乳酸和CO2的過程。該過程除了能夠降低酒液酸度外，還可以調節酒的香氣和口感。酒酒球菌、乳桿菌和片球菌等可以通過糖苷酶水解香氣前體物質影響酒體香氣特征。

綜上，發酵香氣的形成不再單一地依賴釀酒酵母，利用釀酒酵母、非釀酒酵母以及乳酸菌等多菌種間的相互作用調控果酒風味品質將受到更多關注，今后對多菌種間的分子相互作用機理應作深入研究。

2.2 風味相關生物酶對香氣的影響

果酒釀造過程可將水果果實中以糖苷鍵合態形式存在的風味物質解離釋放到酒中。釀酒微生物能夠代謝產生一些風味酶，包括糖苷酶、果膠酶、蛋白酶等，這些酶能夠水解香氣前體物質，從而促進香氣化合物的釋放。在釀造前加入外源糖苷酶、果膠酶和糖基水解酶可提高果酒的風味品質。

2.2.1 糖苷酶

糖苷酶可以促進水果中糖苷香氣前體物質的釋放，主要包括萜烯類和一些多酚類化合物，從而增強和豐富果酒的風味。糖苷鍵合態前體物質本身不具有香氣活性，但可以在β-糖苷酶等香氣形成關鍵酶作用下轉化為具有香味的香氣物質。

一些非釀酒酵母包括假絲酵母屬（Candida）、畢赤酵母屬（Pichia）、漢遜酵母屬（Hanseniaspora）等均表現出良好的β-葡萄糖苷酶活性。

2.2.2 果膠酶與蛋白酶

果膠酶可破壞植物細胞壁結構，將果膠聚合物降解為半乳糖醛酸，從而促進果汁澄清過濾。同時，在果酒發酵前的浸漬過程中，果膠酶可以將糖苷鍵合的風味前體切割成芳香活性苷元，從而增強果酒的風味特性。

蛋白酶主要通過為酵母提供氮源影響果酒香氣的形成。非釀酒酵母是蛋白酶的重要來源。

2.2.3 其他酶

關鍵的單萜和降異戊二烯香氣化合物在釀酒過程中被酵母和產香細菌分泌的糖苷酶、酯酶、C—S裂合酶和脫羧酶等降解為游離態釋放。目前，提高單帖類化合物策略主要有以下兩種：一種是在發酵過程中或發酵后添加來自其他微生物的外源性酶制劑以改善糖基化結合物的水解；另一種是采用少數非釀酒酵母，如葡萄汁有孢漢遜酵母的水解酶活性較高，能夠促進與糖苷結合的單帖類物質前體水解，導致單萜類物質含量增加。從以上研究結果可以發現，發酵過程中添加風味胞外酶和某些非釀酒酵母可以有效改善成酒的品種香氣。其主要原理是利用外源酶或非釀酒酵母分泌的高活性糖苷酶水解水果果皮中的香氣糖苷前體，從而釋放游離態品種香氣成分，增強果酒的典型風味。

2.3 發酵前處理工藝對香氣的影響

在葡萄破碎期間，酶促氧化反應、β-胡蘿卜素物質（其他類胡蘿卜素）的降解被認為能夠產生多種類型的降異戊二烯類物。這類化合物主要包括β-大馬士酮（奇異水果的香氣）、β-紫羅蘭酮（紫羅蘭花的香氣）、3-氧代-β-紫羅蘭酮（煙草氣味）和Vitispirane（新鮮的花香果香和/或異國花卉和泥質木本植物的香氣）等。低溫冷浸漬工藝可以保留小分子香氣化合物，增加香氣復雜性。在釀酒酵母與畢赤酵母混合發酵過程中，適度延長冷浸漬時間（3 d），3-甲基丁醇、乙酸乙酯和乙酸異戊酯的含量會明顯增加。由于天然酵母、微生物和相關酶的作用，較高含量的己醇、順-6-壬烯醇主要是在浸漬過程中形成。冷浸漬過程中一些耐低溫的產香酵母可以使葡萄酒的主香氣成分含量增加。

3 產香酵母的選育

酵母產香能力直接影響成酒的風味質量，因此酵母的選育備受重視。酵母的選育方法主要包括自然突變菌株的選育、雜交育種、基因工程育種、誘變育種等。傳統的育種方法以自然突變為主，從不同原料（水果、土壤）中篩選并分離出具有特殊性能的新菌株。雜交育種可以將兩個或多個優良性狀結合，構建具有優良性狀的新菌株。Wang Zhouli等通過原生質體融合技術構建了基于釀酒酵母和乙醇念珠菌的新型重組融合酵母，在釀造香氣濃郁且低酒精度的蘋果酒方面有巨大潛力。

誘變育種方法可以使生物突變率顯著升高，但要獲得性狀優良的正向突變菌株需要花費相當長的時間，并且優良酵母選育涉及到較多的釀酒工藝學指標（如產乙醇能力、發酵速率、高糖耐受性、pH耐受性等），需要進行多年、多點的生產試驗，篩選進程相對較慢。

4 結 語

本文綜述了釀酒微生物、酶對果酒香氣的影響，盡管利用產香酵母提高葡萄酒風味的復雜性越來越普遍，但非釀酒酵母在其他果酒生產中的應用仍然很少。且果酒中部分關鍵風味化合物的合成途徑及微生物代謝通路仍需要進一步研究。當前，果酒釀造過程中釀酒酵母與非釀酒酵母分子相互作用機制仍不清晰，高通量技術可用于揭示微生物的相互作用，從而有利于更好地設計混合培養物，提升混菌發酵的控制水平。此外，果酒陳釀周期較長，但目前催陳技術仍不成熟，有待進一步研究。未來，在全基因組測序技術快速發展的帶動下，基因組學、蛋白質組學、代謝組學以及風味組學的相關技術也將促進對微生物合成風味化合物代謝途徑的認識和對風味代謝物質調控機理的探索，為創制果酒增香釀造技術奠定基礎。