如何通過(guò)OD值判斷細(xì)菌生長(zhǎng)階段
微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析的核心技術(shù)與實(shí)踐要點(diǎn)
一、基本原理與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
1. OD值測(cè)量原理
光密度（OD???）反映菌液在600nm波長(zhǎng)下的吸光度，與培養(yǎng)液中菌體密度呈正相關(guān)（朗伯-比爾定律）。需注意：
? 線(xiàn)性范圍限制：僅在OD???=0.1~0.8時(shí)與活菌濃度呈線(xiàn)性關(guān)系（因高濃度下光散射效應(yīng)增強(qiáng)）。
? 校正必要性：使用無(wú)菌培養(yǎng)基調(diào)零，扣除培養(yǎng)基成分（如色素、膠體顆粒）的背景干擾。
2. 標(biāo)準(zhǔn)操作流程
步驟
操作規(guī)范
接種與培養(yǎng)
取對(duì)數(shù)中期菌種接種至新鮮培養(yǎng)基（接種量1%~5%），最適溫度下恒溫振蕩培養(yǎng)（如細(xì)菌37℃）
取樣頻率
遲緩期每60分鐘取樣；對(duì)數(shù)期每30分鐘；穩(wěn)定期后每1~2小時(shí)（依菌種倍增時(shí)間調(diào)整）
OD值測(cè)定
分光光度計(jì)檢測(cè)前混勻菌液，比色皿光程1cm，測(cè)定后立即稀釋超線(xiàn)性范圍樣本
曲線(xiàn)繪制
時(shí)間（h）為橫軸，OD???為縱軸，擬合"S"型生長(zhǎng)曲線(xiàn)
二、生長(zhǎng)階段特征與判定標(biāo)準(zhǔn)
1. 遲緩期（Lag Phase）
? 判定依據(jù)：OD???≤0.1且變化率＜0.02/h
? 生物學(xué)本質(zhì)：菌體合成酶系及適應(yīng)新環(huán)境，細(xì)胞數(shù)量未顯著增加
? 誤差排除：若OD持續(xù)下降，需驗(yàn)證菌種活性或培養(yǎng)基兼容性
2. 對(duì)數(shù)期（Exponential Phase）
? 核心特征：
? OD???呈指數(shù)增長(zhǎng)（曲線(xiàn)斜率恒定）
? 倍增時(shí)間（td）
? 實(shí)踐要點(diǎn)：
? 嚴(yán)格對(duì)數(shù)期：OD???每30~60分鐘翻倍（如0.2→0.4→0.8）
? 最佳操作窗口：OD???=0.3~0.6時(shí)取樣（此階段菌體代謝旺盛，形態(tài)均一）
3. 穩(wěn)定期（Stationary Phase）
? 轉(zhuǎn)折標(biāo)志：
? OD變化率下降＞80%（如增速?gòu)?.3/h降至＜0.05/h）
? 連續(xù)3次測(cè)量波動(dòng)＜±0.02（提示營(yíng)養(yǎng)耗盡/代謝產(chǎn)物累積）
? 驗(yàn)證方法：同步平板菌落計(jì)數(shù)（CFU），活菌數(shù)達(dá)峰值且維持穩(wěn)定
4. 衰退期（Death Phase）
? 明確信號(hào)：
? OD???持續(xù)下降（降幅＞0.05/h）
? 鏡檢可見(jiàn)細(xì)胞自溶、碎片增多或芽孢釋放（芽孢桿菌屬）
三、關(guān)鍵干擾因素與誤差控制
1. OD值與活菌數(shù)的偏差機(jī)制
場(chǎng)景
原因分析
解決方案
穩(wěn)定期OD維持高位
死細(xì)胞未裂解
結(jié)合FDA染色或CFU驗(yàn)證
對(duì)數(shù)期OD異常波動(dòng)
菌體聚集成團(tuán)
超聲處理或添加分散劑（如Tween80）
低濃度區(qū)（OD＜0.1）
超出檢測(cè)限
延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間觀察趨勢(shì)
2. 菌種特異性校準(zhǔn)
? 細(xì)菌：通常OD???峰值1.0~2.0（如大腸桿菌）
? 酵母：OD???可達(dá)5.0+（因細(xì)胞尺寸大）
? 絲狀菌：需改用干重法或DNA含量測(cè)定（OD值不適用）
四、標(biāo)準(zhǔn)化操作體系（以大腸桿菌為例）
接種OD???=0.05
遲緩期：OD??? 0.05→0.1
對(duì)數(shù)期：OD??? 0.1→0.8
穩(wěn)定期：OD??? 0.8~0.9
衰退期：OD???↓至0.6
配套驗(yàn)證措施：
? 電鏡觀察細(xì)胞分裂相（對(duì)數(shù)期＞90%細(xì)胞分裂）
? 監(jiān)測(cè)葡萄糖濃度（對(duì)數(shù)期速降，穩(wěn)定期趨零）
? 檢測(cè)pH變化（產(chǎn)酸菌pH持續(xù)下降提示對(duì)數(shù)期）
五、結(jié)論與行業(yè)應(yīng)用
1. 核心價(jià)值：OD值動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)是低成本實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵過(guò)程的黃金標(biāo)準(zhǔn)
2. 升級(jí)策略：
? 聯(lián)用在線(xiàn)傳感器（如pH、溶氧探頭）構(gòu)建多參數(shù)模型
? 結(jié)合qPCR檢測(cè)rRNA基因拷貝數(shù)，精準(zhǔn)量化活性生物量
3. 警示點(diǎn)：
? 高密度發(fā)酵時(shí)需稀釋樣本至線(xiàn)性區(qū)間
? 色素產(chǎn)物菌種改用特定波長(zhǎng)（如放線(xiàn)菌測(cè)OD???）
