聚焦轉染之Merck篇——總有一款產品能滿足你的需要
德國默克是世界上歷史最悠久的化學制藥公司之一。已有335年歷史的默克公司于1998年收購了美國CN Bioscience集團(包括Calbiochem，Oncogene，Novabiochem和Novagen四大品牌)，CN Bioscience(現已改名為MERCK Bioscience)的四大品牌分別在生化、信號傳導、蛋白質化學和分子生物學領域內均以創新而優質的產品著稱。另外，默克生化小組(中國)還獨家代理了以其優質文庫 等分子生物學產品著稱的Stratagene產品在中國的業務。
轉染 技術包括了將DNA、RNA、蛋白等生物大分子傳遞到真核細胞內部，這在Merck旗下的玲瑯滿目的轉染試劑中得到最好的體現，因為無論是DNA、 RNA或者是蛋白轉染，Merck總有一款專門設計的產品能滿足你的需要――要知道Novagen和Stratagene可都是分子生物學產品中響當當的角色。花多難免眼亂，這么多試劑該如何選擇，各自有什么特點呢 。
蛋白轉染 試劑
轉染 在廣義上的定義是指將動物的DNA或RNA，蛋白質以及大分子轉送進入活體細胞中。很多時候，將DNA轉進細胞也是為了讓它表達，但是DNA轉染存在一些問題，比如存在各種因素可能影響表達效果和表達產物的活性;表達時間長(24—72hr);表達量難以控制;表達產物對細胞生長有毒時就無法區分其功能和毒性，DNA載體上的其他元件也可能會干擾細胞的功能，不適于表達較大的分子或者多亞基分子，DNA可能會整合到染色體組上等等——如果直接將完整的蛋白質轉進去是不是更好呢?對于研究蛋白與蛋白之間的相互作用，蛋白的亞細胞定位，蛋白質周轉(protein turnover，包括蛋白質合成和蛋白質降解以及相關的蛋白酶類等)、信號傳導通路和細胞凋亡，以及轉錄因子介導的基因調控的研究，或者研究一個外源蛋白在哺乳細胞中的作用，最快速直接、有效的方法就是將蛋白直接轉染到細胞中去，因此，蛋白質轉染試劑就“應運而生”了。
蛋白質轉染 目前遠遠不如DNA或者RNA轉染那么廣泛，原因有很多，比如蛋白質純化比DNA純化困難，轉染蛋白的持續性和穩定性等等，但這種方法卻實實在在的提供給研究人員一個非常有用的工具，可以直接快速而精確地研究蛋白質的功能。我們生物通的編者相信，在不遠的將來蛋白質轉染一定會大放異彩的。所以，即使你一時用不上蛋白轉染，也應該關注這種技術，因為結合自己的實驗你很可能會設計很有創意的應用。比如，藥物研發中的蛋白質給藥就比基因治療安全，沒有變種的危險;比如研究某個抑制模型時，可以用瞬時補償基因產物來驗證基因的功能;比如可否將HIV抗體直接導入隱藏了的感染T細胞呢?你有更多的創意嗎?只要你敢想，就會發現蛋白質轉染是非常有用的工具!
蛋白“護花使者” ProteoJuice(Novagen)
Novagen的ProteoJuice Protein Transfection Reagent就是一種專門為多肽或者蛋白轉染而設計的試劑，可以與蛋白形成非共價鍵連接，保護蛋白在進入哺乳動物細胞時不被破壞結構，是一種理想的蛋白轉染試劑。并且，ProteoJuice 在保持高轉染率和低毒性的條件下，可以適用于多種細胞(例如A549 COS-7 HepG2 MCF-7 PC12 BHK-21 CV-1 HEK-293 Neuro2A Raw 264.7 CHO-K1 HeLa L6 NIH-3T3等)和各種大小的蛋白，目前已知的，從11kD大小的組蛋白和小肽，到150kD的抗體大蛋白，甚至是蛋白多聚體，比如β- galactosidase tetramer(465kD)，ProteoJuice都已經有了成功的范例。
操作方法：蛋白質轉染復雜嗎?只不過比DNA轉染稍微復雜一點點：培養細胞至80-90%匯片，用無血清培養基稀釋目的蛋白，再加入等比的ProteoJuice，振蕩混勻溫育20min。用無血清培養基洗細胞3—4次，加入轉染試劑—蛋白混合物溫育培養若干小時。通常3—4小時蛋白已經轉入細胞并可以檢測，較大的蛋白如抗體可能需要5小時。如果需要可以在溫育3小時后補加完全培養基。檢測前用無血清培養基或者PBS洗滌細胞以除去未轉染的蛋白，防止影響結果分析，然后就可以分析結果了。
注意事項當然是需要考究蛋白質的濃度和純度(幸好越來越多的蛋白樣本制備工具使得蛋白樣本處理變得簡單高效了，比如Merck自己的蛋白樣品制備系列就有很多選擇，現在還有75折特價呢)，轉染過程中要避免血清的干擾，最后檢測前要徹底洗掉殘留的蛋白。至于效果如何?廠家提供的圖片相當漂亮。
價格和用量：好東西不便宜。蛋白和轉染試劑的用量推薦是1:1，一次24孔板1.25微升就夠了。可以做100次(24孔板)的轉染試劑(0.125毫升)價格要4000多點呢。實驗結果畢竟更重要。記得是4度保存的。
“大肚能容天下”的BioTrek(Stratagene)
Stratagene也有BioTrek? Protein Delivery Reagent，這種適合蛋白、小肽以及大分子轉染、用途廣泛的轉染試劑是一種脂質體轉染試劑，也能夠和蛋白質形成非共價偶聯，并被細胞膜負電荷吸引，經過內吞等幾種不同原理進入細胞膜，進入后即發生解離，釋放完整的蛋白到細胞質。相對而言，BioTrek轉染效率較高(50%—95%)，已知適用成功的細胞系包括293 B16-F0 BHK-21 CHO-K1 COS-1 COS-7 CV-1 HeLa HeLa-S3 HepG2 Jurkat K562 Ki-Ras 267 β1 MDCK NIH 3T3 P19等。BioTrek是24個獨立包裝，操作簡便(僅需3—4小時)，提高了研究工作效率，大大的節約了時間。
操作方法：這個比上面那個更好用一些。培養細胞到匯合度為50—60%，用PBS或者HBS 稀釋樣品蛋白，稀釋的樣品直接加入獨立包裝的BioTrek管中(轉染試劑是凍干在管壁上的，便于運輸保存和使用)溶解混勻，溫育5分鐘，振蕩3—5秒，加入無血清培養基混勻。去掉細胞中的培養基(可用無血清培養基洗一次)并換入無血清培養基，加入轉染試劑盒和蛋白質混合物。保溫孵育4小時，通常多數細胞已經可以檢測到目的蛋白進入細胞，當然可以溫育更長的時間，不過4小時以上最好加一倍體積含20%血清的培養基(終濃度10%)，如果24小時以上就要換培養基了。這個試劑盒還同時提供2種不同的對照蛋白，有FITC標記IgG和beta半乳糖苷酶蛋白作為對照，對于新手再好不過了。記得檢測前要徹底洗掉未轉染的蛋白以免影響結果。
價格和用量： BioTrek? Protein Delivery Reagent(24次獨立包裝，6孔板，如果是24孔板同一個樣品還可以分裝4孔)價格多少?要屏住呼吸，再看——要5700多!價格絕對是“貴妃”級 ——貴到飛起。但是一分錢一分貨，24次獨立凍干包裝非常方便運輸和保存和使用，能保證轉染效果，而且同時提供的2種不同的對照蛋白(一種熒光，一種顏色)非常好用，對實驗的成功或者問題解決非常有幫助——細微之處見真功，絕對是Stratagene的風范(當然，價格貴也是Stratagene的特色:( 為什么好東西總要那么貴呢!幸好不時有6折大促可以偶爾安慰一下我們容易受傷的心)。獨立包裝還有個好處，便于幾個實驗室間分裝降低成本。凍干粉也是要負 20度保存的哦!
DNA轉染
Novagen的GeneJuice Transfection Reagent
陽離子脂質體有一定的細胞毒性作用，通常要求較高的鋪板密度，而且有研究表明脂質體可能干擾細胞功能而造成一些假相。在不懈追求更好的轉染替代產品的過程中，多胺作為一種毒性低、帶多個正價基團可以更好吸附核酸的脂質體替代物而越來越受重視。GeneJuice是一種小分子多胺配方的新型轉染試劑，還添加特殊的無毒蛋白質，幫助獲得更高的轉染效率。經過3年多的用戶驗證，GeneJuice適用的細胞多達130多種。使用方便，不需更換培養基與洗滌細胞，低毒，高效的GeneJuice是一個非常好的選擇。
特點 ：低毒，高效。轉染前后也都不需要更換培養基，轉染后也不用去除轉染復合物，有血清也不怕，據說有血清時的轉染效率可能還會更高些。已經有130多種細胞的成功轉染報告，包括一些難轉染或者原代細胞，http://www.emdbiosciences.com/product/70967這里同樣有這些細胞的列表，雖然不夠詳細，在選擇前還是很值得參考的。GeneJuice主攻項目是DNA轉染。除此之外GeneJuice也可用于轉染大分子DNA、小分子Oligos DNA和 RNA。對于siRNA轉染我們還是建議選擇專項優化的產品。
用量和價格 ：作為剛剛開始在國內推廣的GeneJuice，不久前在生物通網站上派送過一輪免費試用裝，用戶的反響很不錯。現在雖然沒有6折，還可以繼續7折促銷到 9月底，以7折后1毫升RMB2600的價格來看還是滿經濟的，因為以每次6孔板實驗為例，一般1ugDNA建議用3ul轉染試劑就足夠了， 1毫升足夠300多次轉染(6孔板)——如果實驗中總是轉固定的那幾種細胞株，還可以優化條件節約試劑——對付有些細胞 高手每次用2ul也足夠對付了——這就是宣傳資料說最多可轉染500次的出處吧。
操作流程 ：好像現在好用的轉染試劑的操作都已經簡化到差不多最簡了，所以看起來都差不多， GeneJuice也不例外：GeneJuice?——簡便的5步操作(以貼壁細胞轉染為例)
1. 接種細胞——轉染前1天用完全生長培養基在35-mm培養盤接種培養約1–3 × 105 個細胞，37℃(5% CO2) 過夜。轉染前細胞覆蓋率應該達到50–80%。
2. 轉染試劑預處理——按每35-mm培養盤需要量計：在無菌管中加入100 μl無血清培養基，滴加3 μl GeneJuice轉染試劑，徹底渦旋混勻。室溫孵育5分鐘
3. 制備轉染試劑/DNA混合物——每35-mm培養盤需要將1 μg DNA加入GeneJuice轉染試劑/無血清培養基混合物，溫和吸打混勻。(注意：每ug DNA需要2–6 μl GeneJuice轉染試劑)
4. 轉染細胞——將GeneJuice/DNA混合物全部滴加到培養在完全培養基中的細胞上，前后輕搖一下培養盤以確保均勻分布，但避免形成渦流而導致中間濃度過高
5. 細胞孵育——37℃孵育轉染細胞24–72 h小時 (5% CO2)。收集細胞用于分析
注意事項 ：這個轉染操作中以及細胞孵育過程中均不要求更換培養基或者洗滌細胞，因此是目前使用最為簡便的轉染試劑之一。GeneJuice是4度保存的——即使有乙醇做溶劑，也千萬別“萬一不小心放到-20度”了，記得蓋緊蓋子(避免氧化)。保證待轉染細胞的生長旺盛是轉染成功的重要因素，多數情況下鋪板密度 50%—80%(1.0–2.0 × 106)，個別情況根據需要優化吧。稀釋轉染試劑也是要求用無血清培養基的，推薦的轉染試劑和DNA的比例也是黃金標準的3:1，逐滴加入培養皿中時盡量要均勻，前后晃晃就好了，不要旋轉搖形成渦流，以免中間濃度過高。通常情況下 GeneJuice毒性很低，萬一個別細胞對這個成分敏感的話可以適當提高鋪板密度。抗生素和添加劑一般也不建議使用，等轉染后1—2天抗性基因表達后再加選擇壓力。
GeneJuice還有個同名兄弟，Insect GeneJuice，顧名思義適合昆蟲細胞轉染。不過新出的Insect GeneJuice其實是低毒配方的脂質體類轉染試劑而非多胺配方，之所以同名，也許是因為Insect GeneJuice有著和GeneJuice同樣簡便好用的優點。昆蟲細胞表達兼有高產和真核表達的很多優勢，但市面上可供選擇的昆蟲細胞轉染專用試劑很有限，多年來操作麻煩的Cellfectin繼續一支獨秀。新出的Insect GeneJuice可能會是值得留意的新亮點——由于在轉染前后都無需更換培養基或者洗細胞，兼容有血清培養(只要配的時候沒有血清就可以)，也很適合大規模蛋白表達時的轉染或者桿狀病毒共轉染(重組)，操作比Cellfectin方便很多!可惜就是3500/1ml的價格也比 Cellfectin(2500多)貴好多，每次用量還比人家多!圖方便還是圖便宜，就看各人的侃價能力和承受能力了。不過我覺得做昆蟲的同志還是很應該留意一下Insect GeneJuice的，畢竟有了方便好用的新產品，誰還愿意回到從前?
Stratagen公司 GeneJammer Transfection Reagent
另一種多胺專利配方，適用于包括原代細胞在內的多種細胞(懸浮細胞或貼壁細胞)的瞬時轉染或者穩定轉染。正是由于毒性極低的多胺配方，減少了轉染過程中對細胞膜的傷害，而且也避免了脂質體對細胞功能產生的潛在干擾，因此GeneJammer可以保持高轉染效率，除此之外，GeneJammer還有一個最吸引人的地方，就是無論有或無血清、抗生素、生長因子或者其它添加物，GeneJammer都一樣適用。許多好用的轉染試劑都可以在有血清的條件下轉染(甚至轉染效率更高)，但是要求在培養待轉染細胞過程中避免添加青霉素一類的抗生素，以免轉染時細胞毒性太高。那不加抗生素又害怕污染怎么辦呢，毒性超低的 GeneJammer就是答案啦。就從這一點你可以想象GeneJammer毒性超低的意義啦。而且多胺類轉染試劑對某些細胞系效果特別好，比如臍帶血管上皮細胞。
特點 ：低毒高效，避免了脂質體類物質對細胞的毒性或者對細胞功能的干擾，轉染后無需更換培養基或者去除轉染復合物。通常，轉染前后沒有“禁用抗生素或者添加劑”之類的限制。單一的配方，不會沉淀分層，用前無需混勻。
適用的細胞系范圍 ：超過100多種細胞株，同樣包括原代細胞和部分難轉染的細胞系，相當寬的適用范圍。想檢查你的細胞株是否屬于這100多種成功案例之一?看看Stratagene網上的介紹就好啦。
適用的核酸大小 ：DNA，包括大到12kb的質粒，效果都一樣出色。這點很重要，因為通常較大質粒轉染效率會降低。SiRNA?RNA?蛋白質轉染?留給其他專業的同伴吧!
操作流程 ：雖說大同小異，GeneJammer還是有一點不同，培養細胞至60%—80%匯片，用無血清培養基稀釋轉染試劑(10min)，記得不要讓Tips “碰壁”也不要渦旋振蕩，輕輕彈彈混勻就好啦(10min)。加轉染試劑前要先去掉培養皿中的培養基，換成900ul含血清培養基，滴加轉染試劑，溫育3 小時后再補加900ul培養基(如果是懸浮細胞就可以省掉這些麻煩了)，溫育1—3天后看結果或者繼續篩選穩定表達株。這個操作要比前面介紹的麻煩一點，原因可能是讓細胞接觸更高濃度的轉染試劑DNA復合物有助于提高轉染效率?其實稀釋轉染試劑和加DNA的時候也是不能有血清抗生素等添加劑的。但是培養細胞沒有這個限制，還是有自己的優勢的。
注意事項 ：這個也是4度保存的，而且6孔板建議使用6ul和2ugDNA，用量比較多一些。而且1ml價格高達3900多(貴...)，一邊是價格，一邊是使用方便，唉，“站在天平的兩端，一樣的為難……”如果不是碰上特殊的細胞系和特殊需要(比如新手，要用抗生素或者添加劑什么的)，還是等大特價吧。
其他類型的DNA轉染產品
一個人多年形成的習慣，是很難改變的。習慣的力量有多大?在脂質體、多胺類轉染試劑大行其道的今天，古董級的磷酸鈣和DEAE瞬時轉染產品依然在 Stratagene買得到，因為有人就是喜歡。當年Clontech推出了創新的SMART技術的建庫試劑盒后要取消原來的馬拉松建庫試劑盒(從這個名字就可以想象這個Kit的操作有多么艱苦漫長)，竟然遭到很多老用戶的強烈反對，最后繼續保留到今天。Stratagene的MBS Mammalian Transfection Kit等幾個曾經經典的產品也是同樣。而且經過一些改良，這2個曾經“技術要求很高的”的方法也變得不那么復雜了了，轉染效率也提高到十分之一以上。為什么有人始終不離不棄?是因為特別適合某些細胞株?還是因為特別適合某些特殊目的的研究?在一切只求“更高更快更簡便”出結果的今天，不求甚解如我，暫時沒有考究出來，如果有人知道的希望可以email到生物通告訴我，我可以及時更正以免禍害后來人吧。
脂質體轉染大行其道，令Lipofection這個詞家喻戶曉，脂質體當然有自己獨到之處，無怪乎每家都會有自己的脂質體的轉染試劑。 Stratagene的LipoTAXI Transfection Reagent名字真是形象有趣。LipoTAXI在最佳轉染效率與細胞毒性之間找到了一個最佳平衡點，它可以轉染30多種貼壁培養或者懸浮培養的哺乳動物細胞。經過一些實驗人員的使用驗證，LipoTAXI是一種綜合評價較高的轉染試劑。
siRNA轉染試劑
雙鏈RNA經Dicer酶切后會形成21—25nt的雙鏈小RNA，這些稱為siRNA的小東西一旦與mRNA中的同源序列互補結合就會介導mRNA降解，引發“基因沉默”，雙鏈RNA這種對基因表達的阻斷作用就被稱為RNA干擾(RNAi)。由于可以簡單方便地“敲除”某個基因的表達，RNAi技術已經成為研究基因功能的最熱門的有力工具。RNAi的實驗方法有很多(參考生物通新技術專欄的RNAi專輯)，siRNA轉染是最直接有效的一種——除了選擇合適的siRNA，轉染這一步是十分關鍵的——沒有高效的轉染，就無法得到準確的實驗結果，但是轉染質粒DNA的最佳試劑往往不太適合siRNA的轉染(DNA和siRNA的大小差得太遠了，參考RNAi轉染試劑龍虎榜——為你的RNAi實驗選擇合適的轉染試劑)，因此，各廠家紛紛推出了自己的RNAi轉染試劑。Novagen與Stratagene也都有專門為siRNA準備的轉染試劑。
“眼明手快” RiboJuice(Novagen)
Novagen公司以原核蛋白表達的“金字招牌”pET系列載體享譽盛名，在細胞轉染方面雖然Novagen產品不多，卻少而精，在siRNA轉染試劑方面就有RiboJuice? siRNA Transfection Reagent。RiboJuice? siRNA Transfection Reagent是一種高效轉染，低毒設計的siRNA轉染試劑。經典的特點就是操作簡便，即不需要更換培養基，也不必清洗細胞，為操作節約了大量的時間，因此也就提高了轉染效率，增強了轉染效果。另外RiboJuice適用的細胞也比較多，包括A549, BHK，CHO，COS-7，HEK293，HeLa，HepG2，HONE-1, L428, L591, L6, MCF-7, Neuro-2A, NIH 3T3, Primary or first passage rat HSC, Primary aortic smooth muscle, Primary keratinocytes等等。除此之外，RiboJuice還可以和DNA轉染試劑一起實現siRNA和DNA質粒的共轉染，高效沉默外源基因(連同 Novagen另一產品GeneJuice)。
操作流程： 培養細胞到50— 80%匯片，無血清培養基稀釋轉染試劑，5分鐘后加siRNA混勻，再等5—15分鐘就可以直接加入細胞中，等著檢查結果了。如果是共轉染則將 GeneJuice和質粒混合，以及siRNA和RiboJuice的混合物共同加入培養皿中就好了。
價格和用量：24孔板計算每次用2ul轉染試劑，siRNA建議終濃度在0.1nM— 25nM，這個很大程度也取決于這個siRNA的設計的。6孔板建議用6ul轉染試劑。價值2590元的0.3ml包裝的RiboJuice大約可做 150次24孔轉染，或者50次6孔板。你覺得貴嗎?
“因小不失大”的GeneEraser(Strategene)
Strategene公司雖然以高保真PCR酶和文庫構建方面的產品譽滿業內，但由于其獨創性和高品質，Stratagene在其它方面做的也毫無遜色。就像在研究基因功能與基因治療的基因沉默方法這一塊，Stratagene為研究者貢獻了多種新型的研究工具。其中就有siRNA轉染試劑：GeneEraser? siRNA Transfection Reagent。
GeneEraser? siRNA Transfection Reagent是一種確確實實為siRNA轉染準備的轉染試劑。之所以這么說，是因為GeneEraser可以高效直接的將siRNA運送到細胞質中和 mRNA結合，從而導致mRNA降解，完成瞬時轉染或穩定轉染。并且更重要的是，這一試劑只需要很低濃度(1-10nM)的siRNA就可以使特定的基因表達沉默，這對對于RNAi實驗人員來說無疑是十分吸引的。
GeneEraser適用于包括CHO-K1，NIH/3T3，HT-29，A549，293，Hela，Monkey Kidney在內的多種細胞，而且在這些細胞系中轉染效率很高，比如在Hela細胞中的轉染效率可高達95%—100%。 這也是GeneEraser的在siRNA轉染試劑當中倍受好評的一個重要原因。除此之外，相比較于很多陽離子脂質體轉染試劑，GeneEraser低毒性可以顯著減少對細胞的傷害。GeneEraaser還可以在有血清的培養基中轉染，無需更換培養基，這樣就使轉染操作簡便了很多。
操作流程 ：用無血清培養基稀釋GeneEraser，室溫孵育5—15分鐘，加入siRNA再室溫孵育5—15分鐘;將轉染復合物加入剛剛更換新鮮培養基(含血清)的細胞中，繼續培養直到檢測。
用量和價格： GeneEraser也是“貴妃”級的。0.4ml轉染試劑現在價格高達3500，以24孔板計算只能用100—200次，要是6孔板，只能用50—70次。
