細(xì)胞示蹤熒光探針的基礎(chǔ)知識(shí)概述
細(xì)胞熒光探針北歐廣泛應(yīng)用于測(cè)定細(xì)胞總量、干細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)、追蹤活細(xì)胞行蹤，細(xì)胞熒光探針有許多種，由于篇幅原因這就主要介紹以下三種：細(xì)胞增殖示蹤熒光探針CFDA SE、活細(xì)胞熒光示蹤探針VFSE 450、DiI(細(xì)胞膜 紅色熒光探針)。
細(xì)胞增殖示蹤熒光探針 CFDA SE
CFDA SE的全稱(chēng)為Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester，是一種近年來(lái)被廣泛應(yīng)用的細(xì)胞增殖檢測(cè)用熒光探針 ，也可以用于細(xì)胞的熒光示蹤。
基于CFDA SE熒光標(biāo)記的細(xì)胞增殖檢測(cè)和[3H]-thymidine摻入、BrdU標(biāo)記獲得的檢測(cè)結(jié)果完全一致，但同時(shí)可以提供更多的細(xì)胞增殖信息。使用CFDA SE檢測(cè)可以提供整個(gè)細(xì)胞群中有多少比例的細(xì)胞分裂 了1次、2次或更多次數(shù)，同時(shí)如果和其它熒光探針聯(lián)用，可以獲取不同分裂次數(shù)細(xì)胞的其它相關(guān)信息。
CFDA-SE的分子式為C29H19NO11，分子量為557.47，CAS number為150347-59-4。CFDA SE可以通透細(xì)胞膜 ，進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶(esterase)催化分解成CFSE，CFSE可以偶發(fā)性地(spontaneously)并不可逆地和細(xì)胞內(nèi)蛋白的Lysine殘基或其它氨基發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，并標(biāo)記這些蛋白。在加入熒光探針CFDA SE后大約24小時(shí)，即可充分標(biāo)記細(xì)胞。被CFDA SE標(biāo)記的非分裂細(xì)胞的熒光非常穩(wěn)定，穩(wěn)定標(biāo)記的時(shí)間可達(dá)數(shù)個(gè)月。CFDA SE標(biāo)記細(xì)胞的熒光非常均一，比以前使用的其它細(xì)胞示蹤熒光探針例如PKH26的熒光更加均一，并且分裂后的子代細(xì)胞的熒光分配也更均勻。
由于CFDA SE標(biāo)記細(xì)胞的熒光非常均勻和穩(wěn)定，每分裂一次子代細(xì)胞的熒光會(huì)減弱一半，這樣通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)就可以檢測(cè)出沒(méi)有分裂的細(xì)胞，分裂一次的細(xì)胞(1/2的熒光強(qiáng)度)，分離兩次的細(xì)胞(1/4的熒光強(qiáng)度)，分裂三次的細(xì)胞(1/8的熒光強(qiáng)度)以及類(lèi)似的其它分裂次數(shù)的細(xì)胞。采用CFDA SE通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)獲得的檢測(cè)結(jié)果參考右圖。每一個(gè)峰代表一種分裂次數(shù)的細(xì)胞，從右至左的峰通常依次為分裂0次、1次、2次、3次等次數(shù)的細(xì)胞。分裂次數(shù)較多后，分裂0次或1次等沒(méi)有分裂或分裂次數(shù)較少的細(xì)胞會(huì)逐漸減少直至檢測(cè)不到。
使用CFDA SE可以檢測(cè)分裂多達(dá)8次或更多次數(shù)的細(xì)胞增殖。
目前CFDA SE標(biāo)記細(xì)胞后通常用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。最常用于淋巴細(xì)胞的增殖檢測(cè)，也可以用于成纖維細(xì)胞、NK細(xì)胞等其它細(xì)胞的增殖檢測(cè)，甚至還可以用于細(xì)菌增殖的檢測(cè)。
CFDA SE標(biāo)記細(xì)胞呈綠色熒光，檢測(cè)時(shí)的激發(fā)波長(zhǎng)可以選擇488nm，此時(shí)的發(fā)射波長(zhǎng)為518nm，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)可以采用FL1 detection channel。CFDA SE標(biāo)記的細(xì)胞也可以用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。
CFDA SE標(biāo)記的細(xì)胞無(wú)論在體外還是體內(nèi)都不會(huì)使鄰近細(xì)胞染色。即CFDA SE熒光探針完成標(biāo)記后不會(huì)從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到鄰近細(xì)胞。
CFDA SE標(biāo)記細(xì)胞僅需5-15分鐘即可完成。對(duì)于不同細(xì)胞，最佳標(biāo)記時(shí)間需自行摸索。
CFDA SE可以使用無(wú)水DMSO(anhydrous DMSO)配制，配制濃度通常為2-10mM。配制好的溶液宜當(dāng)天使用完畢，不宜長(zhǎng)時(shí)間保存。CFDA SE標(biāo)記細(xì)胞時(shí)的最終濃度通常為0.2-10μM或更高一些。
在工作濃度為5μM時(shí)，一個(gè)包裝的本產(chǎn)品共可以標(biāo)記約1.8升的細(xì)胞。
活細(xì)胞熒光示蹤探針VFSE 450
熒光標(biāo)記細(xì)胞已被廣泛證實(shí)可有效確定總細(xì)胞的數(shù)量和一個(gè)樣本中存在多少活細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合熒光染色法是分析非均質(zhì)細(xì)胞種群的有力工具。非熒光性的FDA和它的衍生物分子進(jìn)入細(xì)胞后被胞內(nèi)無(wú)特異性的酯酶所水解產(chǎn)生熒光。這些熒光產(chǎn)物只能積聚在具有完整細(xì)胞膜的細(xì)胞中。因此，死細(xì)胞無(wú)完整細(xì)胞膜不能被染色。FDA及其類(lèi)似物(如CDCFDA)精細(xì)的跨膜動(dòng)力學(xué)以及胞內(nèi)水解特點(diǎn)與細(xì)胞功能相關(guān)，因此FDA標(biāo)記可以通過(guò)熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)細(xì)胞。然而，因?yàn)镃FSE和它的熒光類(lèi)似物與GFP或者FITC具有相同的激發(fā)光譜，因此CFSE和它的熒光類(lèi)似物不能用于GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞或者FITC標(biāo)記抗體的應(yīng)用中。VFSE染料與CFSE功能相似，因?yàn)樗鼈兌及ッ盖懈詈桶贩磻?yīng)的SE基團(tuán)。VFSE染料能用于多色反應(yīng)，因?yàn)閂FSE與CFSE和它的熒光類(lèi)似物具有不一樣的激發(fā)和發(fā)射光譜， 因此可以用于GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞或者FITC標(biāo)記抗體的應(yīng)用中。
DiI(細(xì)胞膜紅色熒光探針)
DiI即DiIC18(3)，全稱(chēng)為1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，是最常用的細(xì)胞膜熒光探針之一，呈現(xiàn)橙紅色熒光。DiI是一種親脂性膜染料，進(jìn)入細(xì)胞膜后可以側(cè)向擴(kuò)散逐漸使整個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞膜被染色。
DiI在進(jìn)入細(xì)胞膜之前熒光非常弱，僅當(dāng)進(jìn)入到細(xì)胞膜后才可以被激發(fā)出很強(qiáng)的熒光。DiI被激發(fā)后可以發(fā)出橙紅色的熒光，DiI和磷酯雙層膜結(jié)合后的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。其中，最大激發(fā)波長(zhǎng)為549nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為565nm。
DiI的分子式為C59H97ClN2O4，分子量為933.88，CAS number為41085-99-8。
DiI可以溶解于無(wú)水乙醇、DMSO和DMF，溶解度約為1-2.5mg/ml。發(fā)現(xiàn)較難溶解時(shí)可以適當(dāng)加熱，并用超聲處理以促進(jìn)溶解。
DiI被廣泛用于正向或逆向的，活的或固定的神經(jīng)等細(xì)胞或組織的示蹤劑或長(zhǎng)期示蹤劑(long-term tracer)。DiI通常不會(huì)影響細(xì)胞的生存力(viability)。被DiI標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件下可以存活長(zhǎng)達(dá)4周，在體內(nèi)可以長(zhǎng)達(dá)一年。DiI在經(jīng)過(guò)固定的神經(jīng)元細(xì)胞膜上的遷移速率為0.2-0.6mm/day，在活的神經(jīng)元細(xì)胞膜上的的遷移速率為6mm/day。
DiI除了最簡(jiǎn)單的細(xì)胞膜熒光標(biāo)記外，還可以用于檢測(cè)細(xì)胞的融合和粘附，檢測(cè)發(fā)育或移植過(guò)程中細(xì)胞遷移，通過(guò)FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)檢測(cè)脂在細(xì)胞膜上的擴(kuò)散，檢測(cè)細(xì)胞毒性和標(biāo)記脂蛋白等。
用于細(xì)胞膜熒光標(biāo)記時(shí)，DiI的常用濃度為1-25μM，最常用的濃度為5-10μM。DiI可以直接染色活的細(xì)胞或組織，染色時(shí)間通常為5-20分鐘。對(duì)于固定的細(xì)胞或組織，通常宜使用配制在PBS中的4%多聚甲醛進(jìn)行固定，使用其它不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ簳?huì)導(dǎo)致熒光背景較高。
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