大腸桿菌雜交

一、實驗原理

Lederberg和Tatum（1946）選用典型的大腸桿菌為材料，篩選營養缺陷型。利用雙重和三重缺陷型的菌株，在簡單的合成培養基上混合培養，在此培養基上只有重組子能長，親本不能長，即所謂選擇性培養，使細菌 雜交獲得成功。圖12-1說明了細菌的基因重組是不同基因型的細菌經接觸，接合后隨之發生交換和雜種細菌分離的過程。

大腸桿菌的雜交試驗中發現有些菌株經混合培養能得到重組子，有些卻不能。1952年Hayes做了一個實驗，他所用的二個菌株是菌株A和菌株B。菌株A是不能合成甲硫氨酸和生物素；菌株B是蘇氨酸、亮氨酸和維生素B1的三重缺陷型。Hayes首先篩選鏈霉素抗性突變型ASr和BSr，然后在不含鏈霉素的基本培養基上進行正反雜交，結果沒有不同，但在含鏈霉素的基本培養基上進行正反雜交，結果卻不一樣，在ASs×BSr雜交中能得到重組子，可是ASr×BSs雜交中卻并不出現重組菌落。這一現象說明大腸桿菌中有不同的“性”，它與致育因子F有關。同時按細胞中有無F因子將大腸桿菌分為二類，有F因子的為F+，沒有F因子為F-。F因子是一個小的DNA環狀分子，分子量約4.5×106道爾頓。帶有F因子的細胞，表面有一種稱為性菌毛的毛狀突起，長約1至20μ。性菌毛上有雄性專一噬菌體（MS2、k17、f2、Qβ等）的吸附位點，又和細胞的接合有關。F因子在細胞中能以二種狀態存在；游離狀態和整合到寄主染色體 的一定位置。以致帶有F因子的大腸桿菌可分為二類：F+和Hfr菌株。經吖啶橙處理F+變為F-，而Hfr性質不變，說明F因子在F+菌株中呈游離狀態，而在Hfr菌株中則整合到寄主染色體的一定位置（圖12-2）。

大腸桿菌 雜交在F+與F-菌株之間進行，通過細胞的暫時溝通，形成局部合子。在部分合子的形成中，提供部分染色體或少數基因的菌稱為供體菌，提供整個染色體的菌稱為受體菌；所以F+和Hfr是供體細菌，F-是受體菌。F+和F-能雜交，Hfr和F-也能雜交，F-和F-則不能雜交；但這二個可雜交組合其特性不同，主要表現在：1.Hfr細菌和F-細菌雜交以后F-細菌性質不變，F+和F-細菌雜交以后F-細菌轉變為F+（約70％）。2.F+和F-細菌雜交重組頻率10-6，Hfr和F-細菌雜交重組頻率高出F+菌株幾百倍，稱高頻重組。

在F+與F-雜交中，F因子由F+供體高頻轉移到F-受體，低頻轉移宿主染色體的標志。原因是F+群體中每個細胞能轉移性因子到F-受體，只有小部分細胞能轉移染色體的標記。在Hfr與F-雜交中，Hfr供體的染色體由原點（在F因子內）開始轉移進入受體菌，在這過程中F因子被割裂，F因子基因，一些是首先進入，另一些是最后進入。在這類雜交中只有當交配過程長到足以允許整個供體染色體被轉移入F-受體，受體細胞才能由F-變為Hfr。

雜交實驗有多種不同方法，這里介紹的是直接混合培養和液體培養。直接混合培養法操作簡單，適用于確定二個菌株間能否雜交或測定重組頻率的高低，而液體培養適宜于細菌的基因定位。

二、實驗材料

大腸桿菌（EscherichiacoliK12）的四個菌株：K12Pro（λ）F+；W1485HisIleF+；W1177ThrLeuthixylGalaramtl mallacstrr（λ）F-；HfrCMetTrp。

Pro：脯氨酸，（λ）：原噬菌體整合在染色體上，His：組氨酸，ilv：異亮氨酸纈氨酸，Thr：蘇氨酸，Leu：亮氨酸，thi：維生素B1，xyl：木糖，Gal：半乳糖，ara：阿拉伯糖，mtl：甘露醇，mal：麥芽糖，lac：乳糖，strr：鏈霉素抗性，Met：甲硫氨酸，Trp：色氨酸。

三、實驗器具和藥品

1.用具：滅菌培養皿（9厘米），滅菌三角瓶（150毫升），滅菌吸管（1、5、10毫升），滅菌離心管，滅菌空試管。