質(zhì)粒DNA提取
① 加入solution.lll，經(jīng)10min離心后細(xì)菌為什么不結(jié)實(shí)，有的漂浮在液面，有的貼在離心管壁上，一搖晃就破碎脫落下來？
細(xì)菌的用量太少，導(dǎo)致產(chǎn)生的沉淀主要是鹽分的沉淀，因?yàn)槿鄙僮冃缘募?xì)菌蛋白和細(xì)菌基因組DNA的纏繞，沉淀就顯得不結(jié)實(shí)。
解決方法：增加細(xì)菌的用量。
② 加入soln.lll后，經(jīng)10min離心后細(xì)菌沉淀為什么不結(jié)實(shí)，呈大塊的水泡狀并且上清較少？
（1）使用了過多的細(xì)菌，導(dǎo)致菌體未被有效裂解。
解決方法：減少細(xì)菌用量（減半）。
（2）細(xì)胞懸浮不充分，存留小菌塊，導(dǎo)致菌體未被有效裂解。
解決方法：注意將細(xì)菌懸浮充分。
（3）加Solution lll后中和不充分。
解決方法：如果細(xì)菌用量較多，注意多翻轉(zhuǎn)幾次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花狀（也可以稍微用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花狀）。
（4）Solution ll出現(xiàn)沉淀。
解決方法：如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度低于15℃，使用試劑盒前要注意觀察Solution ll中是否出現(xiàn)沉淀。如果出現(xiàn)沉淀，要在37℃水浴溶解沉淀后再使用。
（5）Solution ll長時(shí)間暴露于空氣中被被CO?中和，導(dǎo)致菌體未能被有效裂解。
解決方法：可以用經(jīng)典堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA方法中的ll液替代Solution ll使用。
③ 出現(xiàn)嚴(yán)重的RNA污染。
（1）未在Solution l中事先加入RNase A1。
解決方法：補(bǔ)加RNase A1。
（2）加入RNase A1的Solution l長期保存于室溫，導(dǎo)致RNase A1活性下降。
（3）細(xì)菌過量，RNase A1不能有效降解RNA。
解決方法：將細(xì)菌用量減半或增加RNase A1在Solution l中的濃度。
④ 抽提的質(zhì)粒DNA電泳時(shí)為什么會(huì)出現(xiàn)切口、斷裂或是降解現(xiàn)象？
（1）使用的是收集后冷凍保藏的細(xì)菌。
解決方法：使用新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌。
（2）宿主菌富含核酸內(nèi)切酶。
解決方法：增加一步Rinse A洗滌步驟以徹底去除殘留的核酸內(nèi)切酶。或者將質(zhì)粒DNA進(jìn)行乙醇沉淀。
（3）質(zhì)粒DNA在Solution ll中暴露過久，易造成質(zhì)粒DNA的切口斷裂，裂解步驟應(yīng)控制在5min內(nèi)完成。
（4）培養(yǎng)的細(xì)菌被雜菌污染。
解決方法：重新挑取單菌落培養(yǎng)細(xì)菌。
⑤ 抽提的質(zhì)粒DNA電泳時(shí)為什么會(huì)出現(xiàn)基因組DNA的污染？
（1）菌體裂解和中和過程中，劇烈混合造成基因組DNA斷裂所致。
解決方法：溫和地進(jìn)行菌體地裂解和中和。
（2）加Solution ll時(shí)操作時(shí)間過長，造成基因組DNA斷裂所致。
解決方法：將裂解步驟控制在5min內(nèi)完成。
（3）細(xì)菌的質(zhì)量差（反復(fù)凍融的細(xì)菌、陳舊的細(xì)菌、培養(yǎng)條件不合適的細(xì)菌等）中有許多斷裂或降解而游離的基因組DNA。
解決方法：使用生長良好的新鮮細(xì)菌。
⑥ 加樣時(shí)DNA飄出加樣孔外。
忽略或省略了高速離心以甩干殘留的Rinse B的操作步驟。
解決方法：按說明書的操作步驟操作以確保殘留的Rinse B被甩干。
⑦ 質(zhì)粒為什么會(huì)丟失？
細(xì)胞培養(yǎng)不要超過16小時(shí)，否則細(xì)菌會(huì)崩潰，引起細(xì)菌大量死亡，導(dǎo)致質(zhì)粒丟失。有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。
⑧ 大腸桿菌老化。
解決方法：涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。
⑨ 質(zhì)粒拷貝數(shù)低。
由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可以更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。
⑩ 菌體中無質(zhì)粒。
有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。
? 堿裂解不充分。
使用過多菌體培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分。
解決方法：可減少菌體用量或增加(以天根生化的質(zhì)粒小提試劑盒中的溶劑配置為例)溶液 P1、P2 和 P3 的用量。對(duì)低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時(shí)可加大菌體用量并加倍使用溶液P1、P2 和 P3，可以有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。
? 溶液使用不當(dāng)。
溶液 P2、P3 在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁。
解決方法：應(yīng)置于 37℃ 保溫片刻直至溶解為清亮的溶液后才能使用。
? 吸附柱過載。
不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，就要分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如 TB 或 2×YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)粒是非常高的拷貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長率，則需減少 LB 培養(yǎng)液體積。
? 質(zhì)粒未全部溶解（尤其是當(dāng)質(zhì)粒比較大的時(shí)候）。
解決方法：洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長溶解時(shí)間。
? 乙醇?xì)埩簟?/span>
解決方法：漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。
? 洗脫液加入位置不正確。
解決方法：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。
? 洗脫液不合適。
DNA 只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液 EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.0)或水。洗脫效率還取決于 pH 值，最大洗脫效率在pH 7.0-8.5 間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其 pH 值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。
? 洗脫體積太小。
洗脫體積對(duì)回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，產(chǎn)品濃度降低，為了得到較高回收率可以增大洗脫體積。但也需要看質(zhì)粒拷貝數(shù)，有濃度要求的洗脫體積就不能增大。
? 洗脫時(shí)間過短。
洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有一定影響。洗脫時(shí)放置 1 分鐘可達(dá)到較好的效果。
