植物組織中ATP酶活力的測(cè)定
簡(jiǎn)介
了解ATP酶在植物代謝過(guò)程中的作用，掌握ATP酶活力測(cè)定的原理和方法。
原理
ATP酶（adenosine triphosphatase）可催化ATP水解生成ADP及無(wú)機(jī)磷，這一反應(yīng)放出大量能量，以供生物體進(jìn)行各需能生命過(guò)程。它存在于生物細(xì)胞的多個(gè)部位，如細(xì)胞質(zhì)膜上、葉綠體類囊體膜上，對(duì)整個(gè)生命的維持有著重要的作用。在生物學(xué)研究中，常通過(guò)測(cè)定酶促反應(yīng)釋放的無(wú)機(jī)磷量或ATP的減少量以及pH變化等來(lái)測(cè)定ATP酶的活力。
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)酶促反應(yīng)過(guò)程中無(wú)機(jī)磷的釋放量來(lái)測(cè)定葉綠體偶聯(lián)因子ATPase的活力。偶聯(lián)因子是分布在葉綠體類囊體膜表面的一種復(fù)合蛋白，它在光合作用能量轉(zhuǎn)換反應(yīng)中起重要作用。
在正常情況下，膜上的偶聯(lián)因子催化光合磷酸化反應(yīng)（ATP合成）的速率很高，而水解ATP的活力是十分低的，但用二硫蘇糖醇（DTT）、胰蛋白酶或較高溫度等激活后。它水解ATP的活力可大大增加。因此，偶聯(lián)因子的測(cè)定常用激活后的ATPase水解ATP的活力來(lái)表示。
材料與儀器
材料：新鮮菠菜葉片。
試劑：
①1 mol · L-1 Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）：稱 57 g Tris 溶于 400 mL 蒸餾中，用濃鹽酸調(diào)至pH 8.0,再加蒸搐水至500 mL。
②5 mol?L-1硫酸溶液：取27. 8 mL（相對(duì)密度1.84）濃硫酸，慢慢加入70 mL蒸餾水中，冷卻后定容至100 mL。
③10% 硫酸鑰酸鉉溶液：稱10 g鑰酸鏤溶于100 mL 5 mol?L-1硫酸中。
④硫酸亞鐵-鑰酸鉉試劑：稱5 g硫酸 亞鐵，加入10 mL硫酸鑰酸鉉，再加蒸餡水稀釋到70 mL，直至溶解為止（用前臨時(shí)配制）。
⑤STN緩沖液,將0.05 mol · L-1 Tris-HCl pH 7.8緩沖液（內(nèi)含0.4 mol?蔗糖溶液、 0.01 mol · L-1 NaCl溶液）放入冰箱中預(yù)冷。
器材：分光光度計(jì)，水浴鍋，照光設(shè)備（光源50 000 lx）,臺(tái)式離心機(jī)。
步驟
植物組織中ATP酶活力的測(cè)定的基本過(guò)程可分為如下幾步：
（一）葉綠體制備
1. 取準(zhǔn)備好的菠菜葉5 g置于研缽或組織搗碎機(jī)杯中，加入20 mL 0°C下預(yù)冷的STN緩沖 液，很快研磨或搗碎（0.5 min完成），做成勻漿，以4層紗布過(guò)濾去粗渣，濾液于0~2°C下， 200 g離心約1 min,去細(xì)胞碎片，將上清液再于1500 g離心5~7 min,取沉淀懸浮于少量 STN（pH 7.8）中，使葉綠素含量在0.5 mg · mL-1左右。
（二）ATP酶的激活
1. MgH-ATP酶激活液及反應(yīng)液配制（表37-1）。
2. 激活過(guò)程：取已制備好的葉綠體懸浮液1 mL（葉綠素含量約為1 mg · mL-1）,加入 1 mL激活液，于室溫在白熾光50000 lx下進(jìn)行光激活6 min。
3. 反應(yīng)過(guò)程：取3支試管，分別加入上述激活后的葉綠體懸浮液各 5 mL，再加入 0.5 mL的反應(yīng)液，取兩支管置37 °C水浴中（另一支管置冰浴中作空白用）保溫10 min,各加 入0.1 mL 20% 的三氯乙酸停止反應(yīng)。用臺(tái)式離心機(jī)離心后各取上清液0.3~0.5 mL（取樣量按活力大小而改變）供測(cè)定ATP水解的無(wú)機(jī)磷用。
（三） 無(wú)機(jī)磷的測(cè)定
取反應(yīng)后經(jīng)離心的上清液0.5 mL加入2. 5 mL蒸餾水，搖勻后加入2 mL硫酸亞鐵鑰酸鉉試劑，于室溫放置1 min后顯色即穩(wěn)定，置分光光度計(jì)上用660 nm比色測(cè)定吸光度。
（四） 結(jié)果計(jì)算
ATP酶活力的計(jì)算，按表37-2配制不同濃度的無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)液，于分光光度計(jì)上用 660 nm比色測(cè)定吸光度。以無(wú)機(jī)磷濃度作橫坐標(biāo)，所測(cè)得的吸光度作縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 按下式計(jì)算ATP酶活力：
式中s一從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的無(wú)機(jī)磷含量，μ mol；
Vr—反應(yīng)體積，mL；
W一葉綠素的質(zhì)量，mg；
Vs —測(cè)定時(shí)取用體積，mL；
t—反應(yīng)時(shí)間，min。
注意事項(xiàng)
1 .制備葉綠體懸液時(shí)，加入懸浮介質(zhì)速度要緩慢，以便保持葉綠體的完整度。
2. ATP酶激活的條件。
