過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定

簡(jiǎn)介

植物在衰老或者遭受逆境時(shí)，體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)因而累積H2O2，從而使細(xì)胞遭受損傷。過(guò)氧化氫酶普遍存在于植物的所有組織中，可以清除H2O2，是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一。因此，植物組織中過(guò)氧化氫酶活性與植物的代謝強(qiáng)度及抗逆性密切相關(guān)。 掌握紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性的原理和方法。

原理

在240 nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)吸收，過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度（A240）隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而降低。根據(jù)測(cè)量吸光度的變化速度即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶的活性。

材料與儀器

材料：植物葉片。

試劑： 1 mol · H2O2：30% H2O2 大約等于 17.6 mol?L ，

取 30% H2O2 溶液 5.68 mL,稀釋至1 000 mL；

0.2 mol · L-1 pH 7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含1% 聚乙烯毗咯烷酮）。

器材：紫外分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋，離心機(jī)，研缽，0.5 mL刻度吸管，10 mL試管。

步驟

過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定的基本過(guò)程可分為如下幾步：

1. 酶液提取：稱(chēng)取小麥葉片1.0 g加入pH 7.8的磷酸緩沖溶液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至10 mL刻度試管中，用該緩沖液沖洗研缽，并將沖洗液轉(zhuǎn)入刻度試管中，用同一緩沖液定容，4 000 r · min-1離心15 min，上清液即為過(guò)氧化氫酶的粗提液。

測(cè)定：取10 mL試管3支，其中2支為樣品測(cè)定管，1支為空白管（將酶液煮死），按表 40-1順序加入試劑。

25°C預(yù)熱后，逐管加入0.3 mL 0. 1 mol · L-1的H2O2，每加完1管立即計(jì)時(shí)，并迅速倒入石英比色杯中，240 nm下測(cè)定吸光度，每隔1 min讀數(shù)1次，共測(cè)4 min，待3支管全部測(cè)定 完后,計(jì)算酶活性。

結(jié)果計(jì)算：以1 min內(nèi) A240 減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

式中：A240=Aso—（Asi+As2 )/2（Aso 為加入煮死酶液的對(duì)照管吸光度，AS1、AS2為樣品管吸光度）；

Vt一粗酶提取液總體積，mL

V1一測(cè)定用粗酶液體積，mL,

FW一樣品鮮重，g；

0.1一 A240 每下降0.1為1個(gè)酶活單位，U；

t一加過(guò)氧化氫到最后一次讀數(shù)時(shí)間，min。

注意事項(xiàng)

凡在240 nm下有強(qiáng)吸收的物質(zhì)對(duì)本實(shí)驗(yàn)都有干擾。