混合液浸提法
原理
根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見(jiàn)光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)下測(cè)定其光密度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。
根據(jù)朗伯—比爾定律，某有色溶液的光密度D與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即：
D=kCL
式中：k為比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時(shí)，k為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)可通過(guò)測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的光密度而求得。
如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總光密度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下光密度的總和，這就是光密度的加和性。測(cè)定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類(lèi)胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在三個(gè)特定波長(zhǎng)下的光密度D，并根據(jù)葉綠素a、b及類(lèi)胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)即可求出其濃度。在測(cè)定葉綠素a、b時(shí)為了排除類(lèi)胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長(zhǎng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。
已知葉綠素a、b的80%丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm和645nm，又知在波長(zhǎng)663nm下，葉綠素a、b在該溶液中的比吸收系數(shù)分別為82.04和9.27，在波長(zhǎng)645nm下分別為16.75和45.60，可根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式：
D663 = 82.04Ca+9.27Cb （1）
D645 = 16.75Ca+45.60Cb （2）
式（1）、（2）中的D663和D645為葉綠素溶液在波長(zhǎng)663nm和645nm時(shí)的光密度，Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度，以mg/L為單位。解方程組（1）、（2），得：
Ca = 12.72D663 – 2.59D645 （3）
Cb = 22.88D645 – 4.67D663 （4）
將Ca與Cb相加即得葉綠素總量（CT）：
CT = Ca + Cb =20.29D645 + 8.05D663 （5）
另外，由于葉綠素a、b在652nm的吸收峰相交，兩者有相同的比吸收系數(shù)（均為34.5），也可以在此波長(zhǎng)下測(cè)定一次光密度（D652）而求出葉綠素a、b總量：
CT =（D652 × 1000）/ 34.5 （6）
在有葉綠素存在的條件下，用分光光度法可同時(shí)測(cè)定出溶液中類(lèi)胡蘿卜素的含量。
Lichtenthaler等對(duì)Arnon法進(jìn)行了修正，提出了80%丙酮提取液中三種色素含量的計(jì)算公式：
Ca = 12.21D663 – 2.81D646 （7）
Cb = 20.13D646 – 5.03D663 （8）
Cx·c=（1000D470 – 3.27Ca – 104Cb）/ 229 （9）
式中：Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度；Cx·c為類(lèi)胡蘿卜素的總濃度；D663、D646和D470分別為葉綠體色素提取液在波長(zhǎng)663nm、646nm和470nm下的光密度。由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時(shí)，計(jì)算公式也有所不同。葉綠素a、b在96%乙醇中最大吸收峰的波長(zhǎng)分別為665nm和649nm，類(lèi)胡蘿卜素為470nm，可據(jù)此列出以下關(guān)系式：
Ca = 13.95D665 – 6.88D649 （10）
Cb = 24.96D649 – 7.32D665 （11）
Cx·c=（1000D470 – 2.05Ca – 114.8Cb）/ 245 （12）
材料與儀器
植物葉片
96%乙醇 石英砂 碳酸鈣粉
分光光度計(jì) 研缽 剪刀 棕色容量瓶 小漏斗 滴管 電子頂載天平
步驟
1. 取新鮮植物葉片（或其他綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。
2. 稱(chēng)取剪碎的新鮮樣品0.2g，共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2——3ml 96%乙醇（或80%丙酮）研成勻漿，再加乙醇10ml，繼續(xù)研磨至組織變白，靜置3——5min。
3. 取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤(rùn)，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過(guò)濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分小?/span>
4. 用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)袩o(wú)綠色為止。最后用乙醇定容至25ml，搖勻。
5. 把葉綠體色素提取液倒入比色杯內(nèi)。以96%乙醇為空白，在波長(zhǎng)665nm、649nm和470nm下測(cè)定光密度。
6. 按公式（10）、（11）、（12）（如用80%丙酮，則按公式7、8、9）分別計(jì)算葉綠素a、b和類(lèi)胡蘿卜素的濃度（mg/L），（10）、（11）式相加即得葉綠素總濃度。
7. 求得色素的濃度后計(jì)算組織中各色素的含量。
注意事項(xiàng)
1. 為了避免葉綠素的光分解，操作時(shí)應(yīng)在弱光下進(jìn)行，研磨時(shí)間應(yīng)盡量短些。
2. 葉綠體色素提取液不能渾濁。可在710nm或750nm波長(zhǎng)下測(cè)量光密度，其值應(yīng)小于當(dāng)波長(zhǎng)為葉綠素a吸收峰時(shí)光密度值的5%，否則應(yīng)重新過(guò)濾。
3. 用分光光度計(jì)法測(cè)定葉綠素含量，對(duì)分光光度計(jì)的波長(zhǎng)精確度要求較高。如果波長(zhǎng)與原吸收峰波長(zhǎng)相差1nm，則葉綠素a的測(cè)定誤差為2%，葉綠素b為19%，使用前必須對(duì)分光光度計(jì)的波長(zhǎng)進(jìn)行校正。校正方法除按儀器說(shuō)明書(shū)外，還應(yīng)以純的葉綠素a和b來(lái)校正。
4. 在使用低檔型號(hào)分光光度計(jì)（如：72型、125型、721型等）測(cè)定葉綠素a、b含量時(shí)，因儀器的狹縫較寬，分光性能差，單色光的純度低（±5——7nm），與高中檔儀器如島津UV-120、UV-240等測(cè)定結(jié)果相比，葉綠素a的測(cè)定值偏低，葉綠素b值偏高，a/b比值嚴(yán)重偏小。因此，使用時(shí)必須用高檔分光光度計(jì)對(duì)低檔的分光光度計(jì)進(jìn)行校正。
常見(jiàn)問(wèn)題
研磨時(shí)應(yīng)在弱光下進(jìn)行，研磨時(shí)間要盡量短。提取液不能混濁，否則應(yīng)重新過(guò)濾。
