RNA 干擾技術(shù)
簡介
轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制（post-transcriptional gene silencing，PTGS）被稱為RNA干擾（RNAi），與mRNA對應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈 RNA（dsRNA）導入細胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導致其相應(yīng)的基因沉默。
目前為止較為常用的制備 siRNA的方法有化學合成、體外轉(zhuǎn)錄、長片段dsR-NA經(jīng)RNA酶I類降解（如Dicer，E.coli的RNA酶II）體外制備 siRNA，以及通過 siRNA 表達載體或者病毒載體、PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達產(chǎn)生siRNA。
前面的3種方法主要都是體外制備siRNA，并且需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將 siRNA轉(zhuǎn)到細胞內(nèi)。
而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于從轉(zhuǎn)染到細胞的DNA模板中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNA。
這兩種方法的優(yōu)點在于不需要直接操作RNA。
而將制備好的siRNA、siRNA表達載體或表達框架轉(zhuǎn)染至真核細胞中的方法不外乎以下幾種：
磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和1,5-二甲基-1,5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物（polybrene）、機械法［如顯微注射和基因槍（biolistic particle）］和陽離子脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染。
原理
siRNA 表達框架制備siRNA法的基本原理是：siRNA表達框架（siRNA expression cassettes，SEC）是一種由PCR得到的 siRNA表達模板，包括一個RNA聚合酶I啟動子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個RNA聚合酶II終止位點，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中，具體過程如圖所示。
陽離子脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染的基本原理為：脂類的頭部基團之間的離子相互作用，脂類的頭部基團攜帶很強的正電荷，可中和DNA磷酸基團的負電荷，因而陽離子脂類可以與DNA自動形成可與細胞膜融合的單層外殼，從而將DNA導入細胞內(nèi)。
材料與儀器
器材：
①PCR儀、（滅菌）
②細胞培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱
③紫外分光光度計
④顯微鏡
⑤35 mm細胞培養(yǎng)皿
⑥冷凍離心機
⑦0.2 ml和1.5 ml聚苯乙烯 Eppendorf 管
試劑：
①材料：指數(shù)生長的哺乳動物細胞培養(yǎng)物
②siRNA表達框架的PCR模板、上游引物、dNTP混合液、Taq DNA聚合酶、10 x PCR反應(yīng)緩沖液
③Lipofectamine 2000
④細胞生長培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基、0.25％ 胰蛋白酶
⑤3 mol／L CH3COONa（pH 5.2）
⑥TE（pH 8.0）
⑦無水乙醇、70％ 乙醇
步驟
RNAi的基本過程可分為如下幾步：
(一) 試劑配制
（1）上游引物 濃度20 μmol／L。
（2）dNTP混合液 將 dATP、dGTP、dCTP和dTTP鈉鹽各100 mg合并，加去離子水2 ml溶解，用0.1 mol／L NaOH 調(diào)節(jié) pH至7.0～7.5，使其濃度為5 mmol／L，分裝后-20 ℃ 保存。現(xiàn)也有商品化的混合液（各2 mmol／L）供應(yīng)。
（3）Taq DNA聚合酶 5 U／μl，使用時其在50 μl反應(yīng)體積終濃度為1～2.5 U。
（4）10 x PCR反應(yīng)緩沖液 500 mmol/L KCI，100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4), 15 mmol/L MgCl2。
（5）10 x D-Hanks緩沖液 NaCl 80.0 g，Na2HPO4·2H2O 0.6 g，KCl 4.0 g，KH2PO4 0.6 g，三蒸水加至1000 ml，高壓滅菌后4 ℃ 保存。用時按比例稀釋。
（6）0.25％ 胰蛋白酶 胰蛋白酶0.25 g，D-Hanks緩沖液加至100 ml溶解，過濾除菌，4 ℃保存，用前在37 ℃下回溫。
（7）無血清培養(yǎng)基（RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基）三蒸水900 ml，RPMI-1640粉1包（10.4 g），磁場攪拌至完全溶解，加入NaHCO3 2.0 g，完全溶解后加水定容到1000 ml，過濾除菌分裝。
（8）細胞生長培養(yǎng)基（RPMI-1640生長培養(yǎng)基）RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加10％ 小牛血清。
(9) TE 10 mmol/L Tris-HC1，1 mmol/L EDTA，pH 8.0。
（10） 3 mol／L CH3COONa（pH 5.2） 800 ml H2O溶解408.3 g CH3COONa，用冰醋酸 調(diào)節(jié)pH至5.0，用H2O定容至1 L，高壓蒸汽滅菌。
(二) siRNA的設(shè)計（RNAi目標序列的選取原則）
（1）從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二聯(lián)序列，并記下其3＇端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。
有研究結(jié)果顯示（G＋C）含量在45％～55％左右的siRNA要比那些（G＋C）含量偏高的更為有效。
建議在設(shè)計siRNA時不要針對5＇和3＇端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTR），原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響 siRNP核酸內(nèi)切酶復合物結(jié)合mRNA，從而影響siRNA的效果。
（2）將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人、小鼠、大鼠等）進行比較，排除那些和其他編碼序列／EST同源的序列。例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih／gov／BLAST）。
（3）選出合適的目標序列設(shè)計并分別合成正義RNA和反義RNA的下游引物，合成濃度20 μmol／L。通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA，并合成相應(yīng)的引物，以找到最有效的siRNA序列。
(三) PCR反應(yīng)
（1）向一個Eppendorf管中加入10 x PCR緩沖液5 μl，5 mmol／L dNTP混合液2 ul，上游引物1.5 μl，下游引物（S）1.5 μl，模板DNA 1 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，滅菌去離子水補足50 μl；
另一個 Eppendorf 管中加入10xPCR緩沖液5 μl，5 mmol／L dNTP混合液2 μl，上游引物1.5 μl，下游引物（AS）1.5 μl，模板DNA 1 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，滅菌去離子水補足50 μl。
（2）在PCR儀上進行兩步擴增反應(yīng)：94 ℃，變性30 s；72 ℃，90 s，35個循環(huán)。
(四) PCR產(chǎn)物的純化
（1）分別在兩種PCR產(chǎn)物中加入1／5體積的3 mol／L CH3COONa和2倍體積的預冷無水乙醇，充分混勻后，4 ℃放置30 min。
（2）4 ℃，14000 g離心5 min液，吸去上清液，然后用70％ 乙醇洗滌沉淀的DNA，再次離心樣品，棄去上清液，空氣干燥沉淀。
（3）將沉淀下來的DNA溶于TE，測OD值。
(五) 轉(zhuǎn)染
（1）轉(zhuǎn)染前一天，0.25％ 胰蛋白酶消化細胞并計數(shù)，以5x104個細胞／平皿的密度將細胞平鋪于35 mm細胞培養(yǎng)皿上，使其在轉(zhuǎn)染日密度不低于70％。加3 ml含血清、不含抗生素的生長培養(yǎng)基，于含5％～7％ CO2的37℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20～24 h。
（2）在一個聚苯乙烯試管內(nèi)用100 μl無血清培養(yǎng)基稀釋1.0～2.0 μg PCR產(chǎn)物。
（3）在另一個聚苯乙烯試管內(nèi)用100 μl無血清培養(yǎng)基稀釋2～5 μl Lipofectamine2000試劑。Lipofectamine2000稀釋后，在30 min內(nèi)同稀釋的PCR產(chǎn)物混合。保溫時間過長會降低活性。
（4）混合稀釋的PCR產(chǎn)物和稀釋的 Lipofectamine2000，混勻后在室溫下孵育20 min。
（5）孵育DNA-脂質(zhì)體溶液時，用無血清培養(yǎng)基將要轉(zhuǎn)染的細胞洗滌3次，然后向平皿中加入0.5 ml無血清培養(yǎng)基，將組織培養(yǎng)皿再放入含5％～7％CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。
（6）直接將復合物加入到平皿中，搖動平皿，輕輕混勻。
（7）將平皿放在含5％～7％ CO2的37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24～48 h，無需去掉復合物或更換培養(yǎng)基，或者在4～5 h后更換生長培養(yǎng)基也不會降低轉(zhuǎn)染活性。
（8）在細胞中加入復合物24～72 h后，分析細胞抽提物或進行原位細胞染色，檢測報告基因活性。這依賴于細胞類型和啟動子活性。
對穩(wěn)定表達，在開始轉(zhuǎn)染1d后將細胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，2d后加入篩選抗生素。進行穩(wěn)定表達需要數(shù)天或數(shù)周。
(六) 實驗結(jié)果及分析
根據(jù)所要沉默的基因其表達的蛋白質(zhì)的性質(zhì)，選擇相應(yīng)的方法檢測蛋白質(zhì)的表達情況。
注意事項
1．要設(shè)立陰性對照
一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。
通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性。
2．避免RNA酶污染
微量的RNA酶將導致 siRNA實驗失敗。由于實驗環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚、頭發(fā)、所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，因此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。
3．健康的細胞培養(yǎng)物和嚴格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復性
通常，健康的細胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實驗所用細胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實驗，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細胞，否則細胞轉(zhuǎn)染效率會隨時間明顯下降。
4．避免使用抗生素
從細胞種植到轉(zhuǎn)染后72h期間避免使用抗生素。抗生素會在穿透的細胞中積累毒素。有些細胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時需要無血清的條件。
這種情況下，可同時用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實驗，以得到最佳轉(zhuǎn)染效果。
5．通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件
對大多數(shù)細胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細胞（同樣適合實驗靶siRNA），轉(zhuǎn)染48h后統(tǒng)計對照蛋白或mRNA相對于未轉(zhuǎn)染細胞的降低水平。過多的siRNA將導致細胞毒性以致死亡。
6．通過標記siRNA來優(yōu)化實驗
熒光標記的siRNA 能用來分析 siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導入了siRNA的細胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達的下調(diào)結(jié)合起來。
