嗅鞘細(xì)胞的原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
原理
嗅鞘細(xì)胞是在功能上介于施萬細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞之間的一種特殊膠質(zhì)細(xì)胞，是決定嗅神經(jīng)元軸突終生再生的關(guān)鍵因素。它具有神經(jīng)營養(yǎng)、抑制膠質(zhì)增生、瘢痕形成、成鞘等作用，為軸突生長提供了適宜的微環(huán)境及較強(qiáng)的遷移特性，已成為促進(jìn)中樞神經(jīng)再生的理想候選細(xì)胞之一。基于其與成纖維細(xì)胞貼壁能力的不同，目前我們常采用差速貼壁法獲得大量高純度的嗅鞘細(xì)胞。
材料與儀器
2月齡成年大、小鼠
含20%胎牛血清的DF12培養(yǎng)基 D-hanks液 消化液(0.25%胰蛋白酶+0.04%的EDTA) 25μg ml多聚賴氨酸
培養(yǎng)瓶
步驟
1動物斷頭處死后，暴露嗅球，無菌條件下摘取雙側(cè)嗅球，棄除軟腦膜，在鏡下仔細(xì)剝?nèi)⌒嵘窠?jīng)纖維層及嗅小球?qū)印⑷〉玫慕M織剪成約1mm3大小，用D-hanks液清洗2次后，0.125%胰蛋白酶37℃分離消化25min,然后浸入含有20%血清的培養(yǎng)液中終止消化8min,吸出組織，用無血清的DF12培養(yǎng)基清洗1次。最后依照總論的方法用含20%胎牛血清的DF12培養(yǎng)基將其制成單細(xì)胞懸液。
2.將吹打好的單細(xì)胞懸液置于未經(jīng)處理的培養(yǎng)瓶中，37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)18h后，將未貼壁的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)種于另一未經(jīng)包被處理的培養(yǎng)皿中，37℃,5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)36h后重復(fù)以上操作，最后將未貼壁細(xì)胞按照合適的密度接種于經(jīng)25μg/ml多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)器皿中。
3.前3d按1/3量換液，以后每隔2d 1/2量換液（含10%胎牛血清的DF12培養(yǎng)液），37℃,5%CO2培養(yǎng)5-10d。嗅鞘細(xì)胞在接種24h后大部分已經(jīng)貼壁，呈不規(guī)則顆粒樣，胞體折光性較差。培養(yǎng)3d,偶有胞體呈現(xiàn)錐形或紡錘形的細(xì)胞，發(fā)出短小突起，可見蹼狀生長的錐樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞周圍碎片物質(zhì)減少（圖I-7A)。常規(guī)培養(yǎng)5d,大部分細(xì)胞胞體呈扁平樣，胞漿向外延伸，發(fā)出短小、蹼狀突起。10d后少數(shù)為多極星形膠質(zhì)細(xì)胞樣，大部分細(xì)胞呈雙極、三極施萬細(xì)胞樣，胞體立體感強(qiáng)，伸出長而纖細(xì)、柔軟的突起彼此交織成網(wǎng)絡(luò)狀（圖l-7B、C)。另有一些細(xì)胞胞體較大，扁平樣，邊緣不規(guī)則，立體感較差。
注意事項(xiàng)
1嗅鞘細(xì)胞位于嗅球表面兩層即嗅神經(jīng)層和小球?qū)樱崆蛎繉咏Y(jié)構(gòu)間的差別并不十分明顯，即使是在解剖顯微鏡下取材也難以絕對完整地分離。因此，培養(yǎng)物中可能混有某些雜細(xì)胞，主要為來自于血管、軟腦膜等結(jié)締組織的成纖維細(xì)胞，也可見少量星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元等。顯微鏡下取材應(yīng)盡可能仔細(xì)地清除外層的軟腦膜，可顯著減少成纖維細(xì)胞的數(shù)量。
2.原代培養(yǎng)的成年動物嗅鞘細(xì)胞的初始形態(tài)較為特殊，呈不規(guī)則顆粒樣，似“煎蛋”形或花朵狀。初學(xué)者常誤為培養(yǎng)失敗，建議耐心觀察5-7d后，就會發(fā)現(xiàn)細(xì)胞逐漸呈典型形態(tài)。
3.目前嗅鞘細(xì)胞的純化多采用經(jīng)典的差速貼壁法，此法與施萬細(xì)胞的差速純化有所不同。施萬細(xì)胞是在體外基質(zhì)上分化成熟后才實(shí)施純化，而嗅鞘細(xì)胞則利用其在原代取材培養(yǎng)早期時(shí)各種細(xì)胞貼壁能力的不同而將其純化分離。
常見問題
1由于成年大鼠嗅球中星形膠質(zhì)細(xì)胞成分較少，且在此培養(yǎng)條件下難以存活，因此筆者通常選用單次差速貼壁，即單細(xì)胞懸液置于未經(jīng)處理的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)18-24h,去除主要污染成纖維細(xì)胞后便可獲得既有較高產(chǎn)率又保持較高純度的嗅鞘細(xì)胞。
2.體外培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞形態(tài)因供體動物年齡、取材部位和培養(yǎng)條件的不同而有所差異。同時(shí)筆者觀察到，成年小鼠的嗅球嗅鞘細(xì)胞胞體較大鼠的略小，大鼠嗅鞘細(xì)胞發(fā)出的突起粗大、平直，而小鼠的則纖細(xì)、柔軟，提示這可能與種屬差異也有關(guān)。
