背根神經節細胞的原代培養實驗

原理

原代培養是指由體內取出組織或細胞進行的首次培養，也叫初代培養。原代培養離體時間短，遺傳性狀和體內細胞相似，適于做細胞形態、功能和分化等研究。較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養，此時的細胞保持原有細胞的基本性質，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數。但實際上，通常把第一代至第十代以內的培養細胞統稱為原代細胞培養。最常用的原代培養有組織塊培養和分散細胞培養。

材料與儀器

孵化8-12d的雞胚。孕15d及新生1-3d的大、小鼠仔鼠
含10%胎牛血清的DMEM培養基 神經元維持培養基(Neurobasal+B27+谷氨酰胺+20ng mlNGF) 10μM阿糖胞苷(ARA-C)
培養瓶

步驟

獲得消毒動物后詳細的步驟如下：

1．無菌條件下仰臥放置胚胎或仔鼠于冰D-PBS液中，斷頭后打開胸腹腔，除去內臟器官。從頸部椎管開口插入顯微剪，沿脊柱背側中線兩側剪開椎管，去除暴露脊髓后，即在椎間孔旁可見到沿脊柱兩側排列的背根節，用精細顯微攝小心提取，并剝除其被膜。

2.若施行組織塊培養，可用精細顯微剪將每個背根節剖為2-3個植塊，直接接種于涂有鼠尾膠的基質上，加少量含10%胎牛血清的DMEM培養液培養。

3.如若需要背根神經節分散細胞培養，則可將分離好的DRG組織塊收集入0.25%胰蛋白酶液中37℃消化30min。加人10滴胎牛血清終止消化后，900r/min離心5min,去除上清。而后依照總論的方法在含10%胎牛血清的DMEM培養液中制成單細胞懸液，調整細胞濃度為(0.5-1)X105/ml接種細胞于多聚賴氨酸包被的介質上，37℃,5%CO2的孵育箱內培養。

4.以上兩種培養方法24h后均傾去培養皿內種植培養液，改用無血清培養液(Neurobasal+827+谷氨酰胺+20ng/ml NGF)培養。接種第3天，加入細胞分裂抑制劑ARA-C以抑制非神經細胞的增殖，作用48h后半量更換新鮮培養液，以后每周1/2量換液2次。

5.純化培養的DRGs可以存活2個月之久，純度可達96%以上。分散培養的DRG神經元48h可見胞體有光暈感，圓形或橢圓形，大小不一，有多極、雙極和假單極神經元。2d后給予抑制劑處理后，DRG突起生長迅速，形成稀疏網絡狀結構。隨著培養時間的延長，神經元突起的主干和分枝明顯延長并增粗，神經突起網絡變得更加致密，雜質細胞已經脫壁漂浮，培養物背景變得干凈清晰很多，免疫細胞化學進一步鑒定培養細胞為神經絲(NF)陽性（圖1-3)。

注意事項

1.組織塊培養中，由千背根節被膜的剔除較為困難，將每個背根節剖為2-3個植塊則更有利于細胞從植塊中爬出，明顯提高植塊的存活率。

2.獲取組織的消化培養時間要視動物年齡做相應的調整，即胚胎期可以控制在20-30min,而仔鼠可以在30-50min內。

3.隨著無血清培養基的推廣，最新文獻報道也將其運用千DRG的培養。但有所不同的是無血清培養基可以直接用于接種海馬、皮層等中樞神經元，而DRG則需含血清培養基先接種培養24h后，再換無血清培養基以維持培養，這一點至關重要，否則DRG不能成活。

4.細胞純化培養時，注意把握ARA-C加入的時間點。若細胞密度較高，無血清培養1d后即可加入，而出細胞密度較低時則需2d后再加入。另外逐步1/2量換去含ARA-C的無血清培養液是保證DRG神經元高純度的關鍵步驟。

常見問題

1.解剖方法上，在DRG分離過程中，腹側解剖暴露脊髓至關重要。筆者嘗試從背側解剖路徑取材不容易獲得完整的DRG組織，從而影響細胞的獲得率。

2.筆者選用鼠尾膠原作為培養基質，發現神經元胞體及軸突的貼壁能力更強更穩定，適于長期觀察；而生長在多聚賴氨酸基質層上的神經元只能在短期內貼壁穩定，隨著培養時間的延長，神經元的突起則會漂浮起來，失去基質的支持。特別是經過純化后的DRG在短期內就會連同整個神經網絡脫壁。

3.小鼠背根節神經元的形態結構和生長分化基本上與大鼠相似，但小鼠背根節神經元的胞體較大鼠稍小。雞胚背根節神經元以假單極為多見，神經突起分枝較少。

4.植塊培養時，應先加少撮培養液覆蓋每個植塊即可，否則植塊會被液體浮起，失去基質的支持而無法生長。

來源：《神經生物學實用實驗技術》第四軍醫大學出版社