內(nèi)溶素活性檢測(cè)

簡(jiǎn)介

作為噬菌體衍生的酶，內(nèi)溶素本質(zhì)是一種蛋白分子，其通過分解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖成分，幫助噬菌體顆粒從細(xì)菌宿主釋放，可在噬菌體復(fù)制過程中表達(dá)，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的關(guān)鍵化學(xué)鍵。

原理

利用內(nèi)溶素對(duì)宿主菌的裂解效果檢測(cè)能夠反映其抗菌活性，將內(nèi)溶素與宿主菌共孵育后，通過濁度測(cè)定統(tǒng)計(jì)加入內(nèi)溶素前后的 OD600 的變化，利用細(xì)菌計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，并在光鏡與透鏡下觀察加入內(nèi)溶素前后宿主菌的形態(tài)差異來檢測(cè)抗菌活性。

用途

為治療抗生素耐藥的細(xì)菌感染提供潛在解決方案。

材料與儀器

儀器：

離心機(jī)、多功能酶標(biāo)儀、光學(xué)顯微鏡

透射電鏡

試劑：

宿主菌（Kp3、CRKP 等，可多選幾種）

LB 培養(yǎng)基、PBS 緩沖液

反應(yīng)緩沖液（0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl，pH 7.4）

3% 磷鎢酸鉀

步驟

1、OD600 測(cè)定分析：

挑取宿主菌單菌落接種于 LB 培養(yǎng)基中過夜，次日以 1:100 的比例接種至新的 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 3 h，至 OD 值達(dá)到 0.8~1.0 之間。

取 1.5 mL 的菌液 16000 g 離心 2 min，PBS 洗滌 2 次后重懸于 500 μL Tris-HCl 緩沖液（含 1% TritonX-100）中，注入 96 孔板中進(jìn)行分析，每孔注入 180 μL，實(shí)驗(yàn)組中加入 20 μL 終濃度為 2 mg/mL 的純化內(nèi)溶素蛋白，陰性對(duì)照組加入反應(yīng)緩沖液，通過多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)。

2、細(xì)菌計(jì)數(shù)法測(cè)定分析：

挑取宿主菌單菌落接種于 LB 培養(yǎng)基中過夜，次日以 1:100 的比例接種至新的 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 3 h，至 OD 值達(dá)到 0.8~1.0 之間。

取 1.5 mL 的菌液 16000 g 離心 2 min，PBS 洗滌 2 次后重懸于 500 μL Tris-HCl 緩沖液（含 1% TritonX-100）中，取出 10 μL 樣本作為零時(shí)刻陰性對(duì)照組，再向原有菌液加入終濃度為 2 mg/mL 的純化內(nèi)溶素蛋白，37 ℃ 孵育 30 min 后取出 10 μL 作為實(shí)驗(yàn)組，采取 10 倍稀釋法對(duì)各組樣品涂布平板計(jì)數(shù)，重復(fù)三次取平均值。

3、光鏡分析：

挑取宿主菌單菌落接種于 LB 培養(yǎng)基中過夜，次日以 1:100 的比例接種至新的 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 3 h，至 OD 值達(dá)到 0.8~1.0 之間。

取 1.5 mL 的菌液 16000 g 離心 2 min，PBS 洗滌 2 次后重懸于 500 μL Tris-HCl 緩沖液（含 1% TritonX-100）中，實(shí)驗(yàn)組中加入 20 μL 終濃度為 2 mg/mL 的純化內(nèi)溶素蛋白，陰性對(duì)照組加入反應(yīng)緩沖液，每組取 50 μL 樣品經(jīng)亞加藍(lán)染色后于光鏡下觀察。

4、透射電鏡分析：

樣品制作同光鏡樣品，每組取 50 μL 樣品滴到有膜的銅網(wǎng)上，靜置數(shù)分鐘后，用濾紙吸取多余的液體，滴上 3% 磷鎢酸鉀對(duì)樣品進(jìn)行負(fù)染色，待干后電鏡下觀察。