DNA 濃度和純度的測定

原理

溴化乙錠（EB）是一種嵌入型染料，其上的一個菲啶環可插入到 DNA 或 RNA 鏈的堆積堿基之間。溴化乙錠的嵌入基團與堿基的接近使二者緊密結合。

DNA 吸收 254 nm 的紫外輻射并傳遞能量給 EB，而 EB 本身在 302 nm 和 366 nm 處有光吸收。吸收的能量在 590 nm 處釋放，并表現為橙紅色熒光。結合的EB的熒光產率遠大于游離 EB 的熒光產率。

EB 結合量的多少與 DNA 的大小和構型有關，而熒光強度正比于嵌入溴化乙錠的量。對于單一構型的同種 DNA 樣品來說，溴化乙錠的嵌入量與樣品溶液的 DNA 含量成正比。

材料與儀器

標準 DNA 樣品（已知濃度的線性化 DNA，以 TAE 稀釋為梯度濃度的一系列標準樣品）

質粒 DNA 的酶切樣品（待測）

溴化乙錠 EB 5 μg/ml（用 PH 8.0的 TAE 稀釋 10 mg/ml 母液制備而成）

紫外透射儀

步驟

1、在黑色塑料板上點兩排溴化乙錠 2 μl 液滴，每排六點。

2、取標準樣品 2 μl 與第一排溴化乙錠混勻，使各點的 DNA 濃度分別為 20、15、10、5、2、1（單位：ng/μl）。

3、取待測樣品經過梯度稀釋后，各加 2 μl 于第二排的溴化乙錠上混勻。

4、把以上塑料板放到紫外投射儀的樣品臺上，關好樣品室門。以短波紫外光激發熒光，觀察每一點的熒光強度或拍照。

5、比較上下兩排的亮度，確定待測樣品的濃度。

注意事項

1、標準樣品含單一種類的 DNA，且大小與待測樣品相近。

2、待測樣品和標準樣品使用同樣的體積。

3、EB 具有中度毒性、強致癌性，操作時切記戴手套，切勿沾染到衣物、皮膚、眼晴、口鼻等。

4、沾有 EB 的用具使用完畢統一集中于回收容器中，經凈化處理后方可棄。

5、該方法只能估計樣品 DNA 濃度，無法得到具體濃度，更推薦使用 Nanodrop 2000 測定 DNA 濃度。

常見問題

1. 如何選擇合適的標準樣品大?。?/span>

答：通過預實驗，選擇大梯度標準樣品估計待測樣品大致大小，再縮小標準樣品梯度進行正式實驗。