細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IF）

簡(jiǎn)介

免疫熒光通過(guò)抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)抗原所在的細(xì)胞或組織進(jìn)行定性或定量。

原理

由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，利用定量技術(shù)測(cè)定含量，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定性和定位分析。

用途

快速直觀顯示所檢測(cè)蛋白的細(xì)胞定位。

材料與儀器

【樣品】貼壁細(xì)胞；

【試劑】4% 組織固定液，PBS，Triton X-100，BSA，熒光二抗，免疫熒光染色二抗稀釋液，抗熒光猝滅封片液，0.25% 胰酶；

【器材】6/12/24 孔板，細(xì)胞爬片（蓋玻片），載玻片，15 ml 離心管。

步驟

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：配置 10% 封閉液；0.2% Triton X-100；

第一天：

1. 取普通潔凈蓋玻片于 75% 乙醇浸泡，無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)吹干，將玻片置于 6/12/24 孔板內(nèi)，種入細(xì)胞培養(yǎng)液過(guò)夜，待細(xì)胞長(zhǎng)至 30%~60% 滿。

2. 按照特定的實(shí)驗(yàn)?zāi)康奶幚砑?xì)胞后，吸盡培養(yǎng)液，用 2/1/0.5 ml PBS 洗兩次，加入 1/0.5/0.25 ml 固定液，室溫固定 15 min。

3. 去除固定液，用 PBS 潤(rùn)洗 3 次，每次 5 min，搖床輕搖。

4. 用 0.2% Triton X-100 室溫通透 5 min，PBS 潤(rùn)洗 3 次，每次 5 min，搖床輕搖。

5. 用封閉液（2/1/0.5 ml/孔）封閉 60 min。

6. 吸去封閉液（勿洗），用一抗（1/0.5/0.25 ml/孔）作用 60 min 或 4 ℃ 過(guò)夜，搖床輕搖。

第二天：

7. 去除一抗，PBS 潤(rùn)洗 3 次，每次 5 min，搖床輕搖。

7. 棄 PBS，加入 1/0.5/0.25 ml/孔稀釋的熒光二抗，室溫避光孵育 40 min，搖床輕搖。

8. 回收熒光二抗，PBS 潤(rùn)洗 3 次，每次 5 min，搖床輕搖。

滴加 DAPI（200/100/50 μl/孔）避光孵育 5 min，PBS 潤(rùn)洗 4 次，每次 5 min，洗去多余的 DAPI。用濾紙吸干爬片上的液體，滴 1 滴抗熒光猝滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，避免氣泡，使細(xì)胞接觸封片液，熒光顯微鏡觀察綠色熒光。

注意事項(xiàng)

1、建議細(xì)胞直接種孔板，采用倒置熒光顯微鏡拍照，這樣可以避免最后挑片時(shí)造成劃片或細(xì)胞片破損以及最后封片可能造成滑片等結(jié)果；

2、若實(shí)驗(yàn)室只有正置熒光顯微鏡，則需要將細(xì)胞植于細(xì)胞爬片。

1）建議直接購(gòu)買處理過(guò)的細(xì)胞爬片；

2）若只有普通細(xì)胞爬片，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強(qiáng)，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過(guò)夜，若用酸浸泡過(guò)夜，第二天先用自來(lái)水小心沖洗掉爬片殘留的酸液，若用 75% 乙醇浸泡，則不需要此步驟。

然后，用洗潔精搓洗爬片，最后用去離子水清洗爬片。置于烘箱 80 ℃ 烘干，再將爬片置于超凈臺(tái)造紫外消毒后備用；

3、根據(jù)所檢測(cè)抗原所在位置來(lái)確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透。若所檢測(cè)抗原表位位于膜蛋白的白外段，則不需要通透；

4、一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果；

5、從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量避光。

6、縮短在熒光顯微鏡下的觀察時(shí)間，1~2 h 為宜。

7、染色后盡快熒光顯微鏡下觀察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。

8、無(wú)/弱染色：烤片溫度過(guò)高，推薦 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過(guò)低，孵育是否時(shí)間過(guò)短等。

9、非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；孵育過(guò)程中干片；抗原熱修復(fù)過(guò)度。

10、染色過(guò)深：一抗?jié)舛冗^(guò)高；染色試濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；染色劑濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

11、通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透，但若檢測(cè)抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，這樣可以通過(guò)通透去除一些水溶性蛋白，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào)；

12、建議設(shè)陰性對(duì)照組，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色；

13、選擇醛類固定液時(shí)，保持其新鮮度，最好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高。

常見問(wèn)題

1、信號(hào)弱或者無(wú)信號(hào)：

1）細(xì)胞或組織樣本保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；2）抗體濃度不合適，參照抗體說(shuō)明書的稀釋濃度，再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索；3）一抗孵育時(shí)間不合適，建議 4 ℃ 過(guò)夜孵育。

2、高背景：

1）封閉不充分；2）抗體濃度過(guò)高；3）抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度過(guò)高；4）清洗不充分；5）樣本變干，染色過(guò)程確保樣品始終浸沒(méi)于液體環(huán)境中

3、非特異性染色較多：

1）固定液殘留，這里需要縮短固定時(shí)間并且在封閉液中加甘氨酸，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色；

2）二抗殘留，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解，只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。