α 突觸核蛋白超聲處理實驗操作步驟（適用于 tau, Aβ 等其他活性蛋白）

材料與儀器

材料：超聲管

儀器：通風櫥、非接觸式超聲波破碎儀或探頭超聲波儀（帶 1/8”尖端的超聲儀）

步驟

1. 收到原纖維后，立即將它們儲存在 -80℃。

2. 提前計劃好需要嘗試的超聲處理設置和原纖維的量以便實驗順利進行。

3. 37℃ 下解凍超聲實驗所需的原纖維的量。

4. 分裝到多個超聲管中，并按之前計劃好的在不同的時間和設置下對它們進行超聲處理。

5. 通過電鏡（EM）查看上述經過超聲處理的樣品，尋找纖維尺寸分布為 ~50nm 的樣品，記錄為最佳超聲處理設置。

6. 解凍未超聲處理的原纖維（收到后儲存在 -80℃ 的原纖維）。

7. 在開始實驗之前在最佳超聲處理設置下進行超聲處理（為達到最好實驗效果，我們建議是在進行超聲處理后立即使用，但如果工作流程不允許，替代方法是：在最佳超聲處理設置下進行超聲處理，等分到所需劑量（體積) ，冷凍等分試樣以備后用。然后他們可以在注射前根據需要解凍超聲處理的等分試樣）。

非接觸式超聲波破碎儀操作設置:

使用 1.5mL 微量管（Microtubes）加蓋，至少 100uL 樣本體積（建議 100-300uL），30 秒開, 30 秒停, 5 個高頻循環。（注：儀器頻率/功率范圍為 20-60kHz 和 25-210 瓦。）

我們建議在較高濃度下進行超聲處理，然后再進行稀釋。超聲處理會增加材料的溶解度和均勻性，因此超聲處理之后再移液和稀釋會更準確。

由于實驗環境還有儀器的不同，并沒有一個一勞永逸的黃金法則，最好的選擇是使用您現有的超聲儀根據您的實驗需求優化超聲處理方案。可以通過沉降分析尋找大部分原纖維變得可溶的超聲參數，或使用 AFM/TEM 確定原纖維長度<50nm 的超聲參數。

探頭超聲波儀操作步驟（改良自 Michael J Fox 機構）

在通風櫥或生物安全柜中執行所有超聲處理的步驟。確保通風柜采用外部管道，不會將廢氣再循環到實驗室內。

1.在 37℃ 下解凍足量的 5mg/mL PFF 然后立即使用。建議再次測量蛋白質濃度，因為凍融可能會改變蛋白質濃度。

2.將 PFF 添加到含有適當體積的無菌 dPBS 的無菌微量離心管中，將 PFF 稀釋至所需濃度。（注：對于小鼠注射，我們通常使用 2-2.5mg/mL 的 PFF。）

3.使用探針超聲儀，以 2 檔功率超聲處理總共 60 個脈沖（每次約 0.5 秒）。在每 10-12 個脈沖之間暫停一下，以防止溶液過度加熱并避免起泡。

注意事項

我們還使用高能水浴超聲波儀測試了該操作步驟，到目前為止的結果表明該步驟也適用于對 PFF 進行超聲處理。水浴超聲波儀可以對封閉管進行超聲處理，對于這種可能生成危險氣溶膠的操作比較安全。然而，當使用浴式超聲處理代替探頭超聲處理時，同樣需要確認原纖維在 ≤ 50nm 的長度，以達到合適的毒性。