微量 RNA 建庫(kù)測(cè)序方案

簡(jiǎn)介

RNA 測(cè)序 (RNA Sequencing，簡(jiǎn)稱 RNA-Seq) ，是基于高通量測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法，可以快速對(duì)基因組中的 RNA 種類和數(shù)量進(jìn)行分析，揭示特定生物學(xué)或疾病發(fā)生過(guò)程中的分子機(jī)制。RNA 文庫(kù)制備通常需要 100 ng 以上的起始 RNA，然而實(shí)際的科研實(shí)驗(yàn)中常會(huì)遇到樣本本身較少或類型特殊，導(dǎo)致 RNA 起始量不足的情況，給建庫(kù)實(shí)驗(yàn)帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)。本章內(nèi)容我們將為大家介紹微量 RNA（單細(xì)胞或低至 10 pg RNA）的特殊建庫(kù)方案。

原理

針對(duì)單細(xì)胞/微量細(xì)胞（1-1000 cells）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，目前使用的是 SMART 擴(kuò)增技術(shù)。

具體步驟及反應(yīng)原理如下：

1、使用 oligo dT 針對(duì) RNA 聚合酶 II 轉(zhuǎn)錄的 RNA（具有 polyA 結(jié)構(gòu)）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（從而避開 rRNA）； 

2、逆轉(zhuǎn)錄到 5 cap 的時(shí)候，逆轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性會(huì)不依賴于 RNA 模板， 在 cDNA 的末端加上多個(gè) C（一般是 3 個(gè)）；

3、然后使用一個(gè)帶有 GGG 的接頭（圖中的 TS oligo）與 CCC 進(jìn)行配對(duì)，利用逆轉(zhuǎn)錄酶的 template switch 特征，繼續(xù)以這個(gè) TS oligo 為模板合成 DNA。這樣 cDNA 的 3』就會(huì)加上 TS oligo 的序列；

4、進(jìn)而以 TS oligo 配對(duì)的引物，對(duì)這個(gè) cDNA 分子進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)此方式，就可以將全長(zhǎng) RNA 進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增；

5、然后對(duì)擴(kuò)增獲得的 DNA 分子進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序及數(shù)據(jù)分析。

材料與儀器

QIAseq UPX 3' Transcriptome Kit (QIAGEN，低至單細(xì)胞或 10 pg RNA 的 3' RNA-seq 建庫(kù)試劑盒）

QIAseq UPXome RNA Lib Kit (QIAGEN，低至 500 pg RNA 全轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)試劑盒，下文實(shí)驗(yàn)步驟基于此試劑盒）

1.5 ml 或 2 ml 離心管、無(wú)菌吸頭

一次性手套

乙醇（96%–100%）

純化磁珠與磁力架

離心機(jī)

Vortex 漩渦震蕩儀

PCR 儀

步驟

1．按表 1 準(zhǔn)備 rRNA 去除反應(yīng)體系，輕微震蕩混勻。

2．按表 2 進(jìn)行反應(yīng)：

3．按表 3 準(zhǔn)備 cDNA 合成反應(yīng)體系，輕微震蕩混勻。

4．將 cDNA 合成反應(yīng)組分加入到 SID-TS-96S 孔板中，輕微震蕩混勻并離心。

5．按表 4 進(jìn)行反應(yīng)：

6．合成后的 cDNA，可以選 8—24 個(gè)放于 1 個(gè) 2 ml 離心管中，多個(gè) cDNA 可以混合構(gòu)建一個(gè)文庫(kù)。

7．加入 1.1X 體積的 QIAseq beads 對(duì) cDNA 產(chǎn)物進(jìn)行純化。

8．室溫孵育 5min

9．將反應(yīng)管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液體變澄清（約 2min），小心移去上清。

10．將反應(yīng)管放置于磁力架上，加入 200 μl新鮮配制的 80% 乙醇清洗磁珠，小心吸除乙醇，勿干擾磁珠。

11．重復(fù)第 14 步的乙醇洗滌一次。

12．在磁力架上孵育 5—10min 或至磁珠晾干，磁珠過(guò)度干燥可能會(huì)導(dǎo)致 DNA 產(chǎn)量降低。

13．使用 22μl 的無(wú)核酸酶水來(lái)重懸磁珠，將反應(yīng)管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液體變澄清，小心吸取 20 μl 的上清至新的 PCR 板中。

14．向每個(gè)樣本中加入 22μl（1.1X）重懸后的磁珠。重復(fù)第 8-12 步。使用 25 μl 的無(wú)核酸酶水來(lái)重懸磁珠，將反應(yīng)管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液體變澄清，小心吸取 23 μl 的上清至新的 PCR 板中。

15．按表 5 步驟進(jìn)行 PCR 儀（需帶有熱蓋）程序設(shè)定

16．按表 6 設(shè)置 PCR 循環(huán)反應(yīng)，PCR 循環(huán)數(shù)參考表 7。

17．加入 40 μl磁珠進(jìn)行純化，室溫孵育 5min

18．將反應(yīng)管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液體變澄清（約 2min），小心移去上清。

19．將反應(yīng)管放置于磁力架上，加入 200 μl新鮮配制的 80% 乙醇清洗磁珠，小心吸除乙醇，勿干擾磁珠。

20．重復(fù)第 19 步的乙醇洗滌一次。

21．在磁力架上孵育 5—10min 或至磁珠晾干，磁珠過(guò)度干燥可能會(huì)導(dǎo)致 DNA 產(chǎn)量降低。

22．使用 22μl 的無(wú)核酸酶水來(lái)重懸磁珠，將反應(yīng)管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液體變澄清，小心吸取 20 μl 的上清至新的 PCR 板中。

23．向每個(gè)樣本中加入 16μl（0.8X）重懸后的磁珠。重復(fù)第 18-22 步。使用 24 μl 的無(wú)核酸酶水來(lái)重懸磁珠，將反應(yīng)管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液體變澄清，小心吸取 22 μl 的上清至新的 PCR 板中。純化后的文庫(kù)可保存在-20°C 直至測(cè)序。

注意事項(xiàng)

1. SMART 技術(shù)的轉(zhuǎn)錄酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，單管反應(yīng)一步完成逆轉(zhuǎn)錄和二鏈合成，不需要額外的 cDNA 純化和二鏈合成反應(yīng)，簡(jiǎn)化了建庫(kù)流程并節(jié)省了操作時(shí)間。

2. 微量建庫(kù)測(cè)序能否成功，在實(shí)驗(yàn)方面一個(gè)重要的因素就是降低核糖體在 Total RNA 中的比例。使用 polyT 引物反轉(zhuǎn)錄雖然能避免 rRNA，但是很難獲得全長(zhǎng) RNA 數(shù)據(jù)。本方案結(jié)合了 rRNA 去除「黑科技」QIAseq FastSelect，整個(gè) rRNA 去除反應(yīng)完美融入逆轉(zhuǎn)錄步驟中，無(wú)需任何操作以及額外純化步驟。這一「黑科技」可將總 RNA 中的 rRNA「封閉」住，使其不能進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、二鏈合成等反應(yīng)，最終無(wú)法進(jìn)入構(gòu)建好的 NGS 文庫(kù)，顯著降低 rRNA 干擾，減少測(cè)序成本的同時(shí)降低數(shù)據(jù)分析難度并提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。且這一方法不受起始樣本量限制，低至單細(xì)胞裂解釋放的 RNA 都可以進(jìn)行 rRNA 去除。

3. 當(dāng) RNA 起始量較低時(shí)，測(cè)序所需的數(shù)據(jù)量也不必過(guò)高，每個(gè)樣本單獨(dú)構(gòu)建文庫(kù)既浪費(fèi)建庫(kù)試劑，又增加了操作時(shí)間。本方案支持 8—24 個(gè) cDNA 混合建庫(kù)，只要將不同樣本反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA 混合純化，構(gòu)建一個(gè)混合 RNA-seq 文庫(kù)即可。高通量測(cè)序后，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄時(shí)引入的樣本標(biāo)簽（Sample ID）拆分出每個(gè)樣本的基因表達(dá)信息即可，節(jié)省成本的同時(shí)也提高了實(shí)驗(yàn)效率。