微生物的誘發(fā)突變實(shí)驗(yàn)-亞硝基胍法
原理
亞硝基胍（NTG，N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍）是一種有效的化學(xué)誘變劑，在低致死率的情況下也有很強(qiáng)的誘變作用，故有超誘變劑之稱。它的主要作用是引起 DNA 鏈中 GC→AT 的轉(zhuǎn)換，亞硝基胍也是一種致癌因子，在操作中要特別小心，切勿與皮膚直接接觸。凡有亞硝基胍的器皿，都要用 1 mol/L NaOH 溶液浸泡，使殘余的亞硝基胍分解破壞。
材料與儀器
枯草芽孢桿菌 BF7658
淀粉培養(yǎng)基 LB 液體培養(yǎng)基 亞硝基胍 碘液 無(wú)菌生理鹽水
玻璃涂棒 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 振蕩混合器
步驟
1. 菌懸液制備
1.1 將試驗(yàn)菌斜面菌種挑取一環(huán)接種到含 5 ml 淀粉培養(yǎng)液的試管中，置37℃ 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
1.2 取 0.25 ml 過(guò)夜培養(yǎng)液至另一支含 5 ml 淀粉培養(yǎng)液的試管中，置 37℃ 振蕩培養(yǎng) 6～7 h。
2. 平板制作
將淀粉瓊脂培養(yǎng)基礅化，倒平板 10 套，凝固后待用。
3. 涂平板
取 0.2 ml 上述菌液放到一套淀粉培養(yǎng)基平板上，用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液均勻地涂滿整個(gè)平板表面。
4. 誘變
4.1 在上述平板稍靠邊的一個(gè)位點(diǎn)上放少許亞硝基胍結(jié)晶，然后將平板倒置于 37℃ 恒溫箱中培養(yǎng) 24 h。
4.2 放在亞硝基胍的位置周圍將出現(xiàn)抑菌圈。
5. 增殖培養(yǎng)
5.1 挑取緊靠抑菌圈外側(cè)的少許菌苔到盛有 20 ml LB 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，搖勻，制成處理后菌懸液，同時(shí)挑取遠(yuǎn)離抑菌圏的少許酋苔到另一盛有 20 ml LB 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，搖勻，制成對(duì)照菌懸液。
5.2 將上述 2 只三角瓶置于 37℃ 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
6. 涂布平板
分別取上述兩種培養(yǎng)過(guò)夜的菌懸液 0.1 ml 涂布淀粉培養(yǎng)基平板。處理后懸液涂布 6 套平板，對(duì)照菌懸液涂布 3 套平板。涂布后的平板，置 37℃ 恒溫箱中培養(yǎng) 48 h。實(shí)際操作中可根據(jù)兩種菌液的濃度適當(dāng)?shù)赜脽o(wú)菌生理鹽水稀釋。注意每套平板背面作好標(biāo)記，以區(qū)別經(jīng)處理的和對(duì)照。
7. 觀察誘變效應(yīng)
分別向 cfu 數(shù)在 5～6 個(gè)左右的處理后涂布的平板內(nèi)加碘液數(shù)滴，在菌落周圍將出現(xiàn)透明圈。分別測(cè)量透明圏直徑與蘺落直徑并計(jì)算其比值（HC 比值）。與對(duì)照平板相比較，說(shuō)明誘變效應(yīng)，并選取 HC 比值大的菌落移接到試管斜面上培養(yǎng)。此斜面可作復(fù)篩用。
凡有亞硝基胍的器皿，都要置于通風(fēng)處用 1 mol/L NaOH 溶液浸泡，使殘余的亞硝基胍分解破壞，然后清洗。
