肝炎病毒的病毒分離與鑒定
簡介
肝炎病毒是指一組主要侵犯肝臟引起病毒性肝炎的病原體，其中有些也可引起腦、肺和心臟的損害。病原學來源不同的肝炎其實驗室檢測差異較大，病原學診斷主要涉及甲、乙、丙、丁、戊五型，包括各種肝炎病毒的核酸定性及定量，抗原組分及抗體等三個層次的檢測，檢查的目的是明確肝炎病因及病毒核酸復制的情況，以協助臨床診斷和治療、流行病學調查以及環境監測。
原理
目以 HAV 和 HBV 感染為例，HAV 感染的實驗室檢測主要包括三個方面：① 在潛伏期或急性期檢查糞便中的甲型肝炎病毒抗原，因為量少且持續時間短，實際很少應用；② 檢測發病早期和恢復期雙份血清中的抗 HAV 抗體；③ 檢測單份血清中抗 HAV IgM 抗體，以區別急性感染與既往感染。
HBV 感染的實驗室檢測主要包括四個方面：生物化學檢測，HBV 血清標志物檢測、HBV 分子生物學診斷以及 HBV 臨床藥物療效檢測。HBV 病原學診斷主要依據 HBV 血清標志物作出判斷，包括病毒的抗原抗體及病毒的核酸兩方面。
肝炎病毒體外培養十分困難。盡管 HBV 可以在健康成人或人胚胎干細胞中生長，這一培養系統不能用于感染性病毒顆粒的增殖。因此，該系統不能用于實驗室的診斷檢測。HCV 病毒培養還處于研究階段。肝炎病毒的細胞培養模型應用性不強，而且因為病毒往往生長緩慢，目前僅用于實驗室研究。
材料與儀器
器材：黑猩猩、土撥鼠、北京鴨
步驟
（一）病毒分離培養
目前動物模型主要用于肝炎病毒的病原學研究、疫苗免疫效果評價及藥物篩選等。
1，實驗動物 HAV 的主要自然宿主為人類及靈長類動物。黑猩猩、獼猴、狹猴、恒河猴等均對 HAV 易感，我國學者毛江森等還最早建立了短尾猴 HAV 感染動物模型。口服或靜脈注射病毒均可使這些動物感染 HAV，并有肝炎癥狀的表現，糞便中出現完整的有感染性的病毒顆粒，同時被感染動物血液中可查出抗 HAV 的抗體。
對 HBV 敏感的動物有樹頤以及黑猩猩、長臂猿和絨毛猴等高等靈長類動物，其中黑猩猩是研究 HBV 的最佳動物模型，但由于道德，經濟及飼養操作不方便等原因，使高等靈長類動物模型的使用受到了限制。人 HBV 感染樹嗣出現各種臨床表現和病毒復制的特征，肝細胞可出現病毒復制并分泌 HBsAg 和 HBeAg，并可發展肝細胞癌。嗜肝 DNA 病毒科的其他成員如鴨乙型肝炎病毒（duck hepatitis B virus，DHBV），土撥鼠肝炎病毒（ wood chuck hepatitisvirus， WHV）及地松鼠肝炎病毒（ground squirrel hepatitis virus ，GSHV）等可在其相應的天然宿主中形成類似人類乙型肝炎的感染，因此可用這些動物作為實驗動物模型。家鴨有很高的 DHBV 感染率，已廣泛用作嗜肝 DNA 病毒的動物模型，我國常用 DHBV 感染模型進行抗病毒藥物篩選以及免疫耐受機制的研究；WHV 在宿主土撥鼠體內引起的病毒生物學效應與 HBV 類似，因而土撥鼠是適于進行病毒復制。細胞感染及癌變機制，抗病毒治療等研究的實驗動物模型。另外， HBsAg 和 HBeAg 轉基因小鼠是用 HBsAg 和 HBeAg 編碼相應基因制備的轉基因小鼠，可為研究 HBV 疫苗及肝細胞癌的病毒性起源提供手段。HCV 最理想的動物模型是黑猩猩，病毒可在其體內連續傳代，但癥狀較輕。對 HDV 敏感的動物有黑猩猩、土撥鼠和北京鴨，可作為 HDV 研究的動物模型。黑猩猩對 HEV 也很敏感。
2．細胞培養 HAV 可在多種原代及傳代細胞中增殖，包括原代械猴肝細胞、傳代恒河猴胚腎細胞（FRhk4、FRhk6）、非洲綠猴腎細胞（Vero）、人成纖維細胞（2BS）、人胚肺二倍體細胞（MRC5 或 KMB17）及人肝癌細胞（PLC/PRF/S）等。1979 年 Provost 首次利用傳代恒河猴腎細胞（FRhk6）成功培養出 HAV。在 HAV 感染的潛伏期末期和急性期早期，可以采取咽拭子或糞便上清液接種敏感細胞進行病毒分離培養和鑒定。目前用于 HAV 分離培養的細胞株主要有 FRhk4 和 2BS，HAV 在培養細胞中增殖速度非常緩慢且不引起細胞病變，病毒經若干代培養后，可逐漸適應細胞，但仍需 20 天才能收獲到最大量病毒。因此，從臨床標本中分離 HAV 常需數周甚至數月，并且需要用免疫學方法檢測病毒的抗原成分才能確定是否有病毒在細胞中增殖。
HBV 體外細胞分離培養尚未成功，目前主要采用全基因組，1.2 倍體或 1.3 倍體 HBV DNA 轉染肝癌細胞進行 HBV 擴增，被轉染的肝癌細胞可表達所有的 HBV 抗原并可進行病毒復制。目前應用較多的人肝癌細胞系有 PIC/PRF/5 細胞系、Hep3B 細胞系。HepG2 細胞系、HepG2.2.15 細胞系。所獲得的體系主要用于 HBV 感染機制和藥物療效評價等研究，檢驗價值不高。HCV 體外復制細胞培養系統 JFH-1/HCVec 由 2 a 型 HCV RNA（JFH-1 株）構建而成，能自我復制并具感染性。HDV 的基因克隆和表達在原核細胞及真核細胞也已獲成功，但 HEV 體外細胞培養困難，迄今仍不能在細胞中大量培養。
（二）病毒的鑒定與分型
1. 免疫電鏡檢查﹐經消化道傳播的病毒性肝炎可采用免疫電鏡檢測患者潛伏期末期和急性期早期糞便、膽汁的 HAV 和 HEV 顆粒，還可用 RIA 或 ELISA 法檢測肝組織中的相應病毒抗原。但這些方法操作較復雜，需特殊設備和技術，且由于病毒在肝組織。膽汁和糞便中存在時間往往較短，陽性率較低，不宜作為常規檢查。
檢測方法：將含 HAV 或 HEV 的細胞提取液 10 000 r/min 離心 30 分鐘，取上清，然后 38 000 r/min 離心 4 小時，沉淀重懸加 1:20 稀釋的抗 HAV 特異血清，37 ℃中和 1 小時，28 ℃過夜，2500 r/min 離心 2 小時，沉淀重懸后滴網，磷鎢酸負染后鏡檢。結果判定：可觀察到成堆實心和空心顆粒，顆粒間有抗體橋形成，根據顆粒的直徑大小，判斷 HAV 或 HEV 的感染。
2. 中和試驗﹑中和試驗可用于 HAV 分離株的鑒定。試驗方法：用已知含 320~1 000 log TCID50/ml 病毒懸液與等量的 1:10 稀釋的抗 HAV 特異血清混合，37 ℃中和 1 小時，接種單層細胞，培養 28~32 天收樣，抽提病毒液，用酶標法檢測 HAV 抗原。同時用 HAV 抗體陰性血清作對照，并設不加血清的病毒對照。結果判定：若分離株能被抗 HAV 血清中和，HAV 抗原檢測為陰性，而抗 HAV 陰性血清對照和病毒對照結果一致，表明分離株為 HAV。
3. 基于核酸檢測的方法
（1）HAV RNA 的檢測：HAV 核酸檢測應用 cDNA-RNA 核酸雜交技術及 RT-PCR 技術檢測標本中 HAV RNA。PCR 引物主要是依據 5'NCR 中的保守序列設計合成。利用 RT-PCR 檢測 HAV RNA，敏感，快速，一般 4~12 小時即可得出結果，可以早期診斷 HAV，以便采取有效預防措施，盡早隔離傳染源，在防止甲肝流行方面有著重要意義。
由于 HAV-cDNA 克隆成功，應用分子雜交技術檢測感染細胞和患者糞便中的 HAVRNA，用 P 標記 HAV-cDNA 片段作探針，與載體上被檢標本中的 HAV RNA 雜交，可用于 HAV RNA 的檢測。
對于牡蠣等貝類產品中富集的 HAV 可使用硅膠膜柱法提取 RNA，然后進行 RT-PCR，并結合 Southern 雜交法進行 HAV 檢測和鑒定。
（2）HBV DNA 的檢測
1）用于 HBV DNA 檢測的 PCR 主要有巢式 PCR，半巢式 PCR，多重 PCR、原位 PCR 及近年發展的實時熒光定量 PCR 等。這些類型的 PCR 靈敏度和特異性高，可用于檢測無血清學標志甚至常規 PCR 檢查陰性的 HBV 感染者。但由于檢測條件要求較嚴格，應在具備條件的實驗室根據需要選用。PCR 檢測 HBV DNA 是一種敏感度很高的方法，因此，實驗過程中控制污染是檢測中的重要問題，應予以足夠重視。
2）核酸雜交檢測 HBV DNA 的方法有斑點雜交法、原位雜交法，核酸印跡雜交法等。① 斑點雜交法：本法簡便。微量，特異性和敏感性均較高，已被廣泛用作藥物療效考核和人群篩檢，適用于大量標本的檢測。② 核酸印跡雜交法：即用標記探針與經瓊脂糖電泳分離并轉印到硝酸纖維素膜上的標本進行雜交的方法。如檢測 HBV 的 DNA 雜交法，該法較斑點雜交法敏感度高，可將特異性 DNA 片段集中于一條區帶上，起到濃縮和純化作用，可檢測肝組織等樣本中的 HBV DNA，特異性高。結果判定：雜交帶的分子量在 3.2kb 的，為游離型 HBVDNA；大于 3.2kb 者為整合型 HBV DNA。若出現許多彌散狀小于 3.2kb 的雜交帶，可認為 HBV DNA 為復制狀態；出現單一或幾個大于 3.2kb 的雜交帶，證明為非復制型。對同一標本，整合型與非整合型、復制型與非復制型的 DNA 可同時存在。③ 原位雜交法：具有高度的敏感性和特異性，而且由于不經核酸提取，其特異核酸不會因稀釋而導致陰性結果，更重要的是該法能在不破壞組織細胞結構的情況下精細地對待測 HBV DNA 進行定位和定量。肝組織的原位雜交可在冰凍切片或石蠟切片上進行，切片經一定處理后再與探針雜交，后顯影觀察結果。結果判定：在細胞核、胞質、胞膜及細胞間隙出現顆粒狀顯色者為 HBV DNA 陽性。
4） HBV 基因分型檢測：常用 HBV 基因分型方法如下：① 序列測定法：最直接，可信度高，但煩瑣費時而且價格昂貴，對混合型感染檢測能力差，不適于大樣本檢測。② 聚合酶鏈反應 - 限制性片段長度多態性分析法（PCR-RFLP）：較測序法簡便，適于大樣本檢測，但由于需要進行酶切，所以操作仍較為煩瑣，成本較高，并存在酶切不徹底等問題。③ PreS2 單克隆抗體酶聯免疫測定（mAbs EIA 法）：簡單，快速，已商品化，適于大樣本檢測，但檢測費用較高，并不能有效鑒別有些混合型感染和 HBsAg 低表達及某些表位表達不充分的標本。④ 分子探針雜交法：簡單，快速，對混合型檢測非常敏感，目前已經商品化。適于大樣本檢測，但檢測費用較高而且靈敏度和特異度還有待提高。⑤ 型特異性引物 PCR 法：簡單，快速，成本低，具有較高的靈敏度，適于流行病學研究和臨床大樣本檢測，但特異性還有待提高。
（3 ）HCV RNA 的檢測：主要包括 HCV RNA 檢測和基因分型。
1） HCV RNA 檢測：檢測肝組織內 HCV RNA 可采用原位斑點核酸雜交法，而血清中 HCV RNA 含量較低，多采用較靈敏的熒光 PCR 和 PCR-ELISA 方法，PCR 引物多選用最保守的 5'NCR 序列。熒光定量 PCR 儀定量檢測標本中的 RNA 拷貝數，可對丙型肝炎患者干擾素治療的療效進行評估。
患者感染 HCV 后 1~3 周，外周血清中即可檢測出 HCV RNA，HCV RNA 出現早于 HCV 抗體，HCV RNA 持續 6 個月以上陽性即為慢性感染。
2） HCV 的基因分型：基因分型對于丙型肝炎流行病學的研究具有重要作用，同時有助于對治療應答情況的預測和療程的優化。目前對 HCV 的基因分型可通過核苷酸測序分析、PCR-RFLP 和型特異探針雜交等方法對 HCV 5'NCR 和其相鄰的核心區進行分析。PCR 檢測也用于評價和分析 HCV RNA 基因變異的程度。5'NCR 的分析主要用于型的鑒別，核心區的分析主要用于亞型的鑒別。HCV 核心區同源率若大于 94% ，為同一亞型；介于 89% 和 94% e 之間為同一型的不同亞型；同源率小于 89% 為不同型。
（4）HDV RNA 的檢測：HDV RNA 檢測主要通過斑點雜交和 PCR 法進行。
（5）HEV RNA 的檢測：應用 RT-PCR 可在患者暴露于病原后第 3~7 周時血清中查到 HEV RNA 的存在，也可檢測糞便或膽汁中的 HEV RNA，有助于確診戊型肝炎。
注意事項
① HBV DNA 檢測可了解 HBV 的復制狀況，作為確診病情的主要依據。如 HBV DNA 測定值>1 000 copies/ml，提示 HBV 有復制，而且病毒 DNA 拷貝數的高低與病毒復制的程度成正相關?？截悢翟礁?，提示病毒復制越活躍，傳染性越強；若結果陰性，則表明病毒處于不活躍階段，病情比較平穩。
② HBV DNA 是目前判斷乙肝抗病毒藥物用藥指征及判斷藥物療效最敏感的指標。乙肝抗病毒治療的標準就是 HBV DNA>1 000 copies/ml，且患者轉氨酶超過正常值兩倍，此時是肝病患者抗病毒治療的最佳時機。HBVDNA 陽性者，即使肝功能正常，必要時也應考慮進行抗病毒治療。HBV DNA 檢查結果還可以在一定程度上輔助判斷 HBV 是否產生了變異，如在治療過程中 HBV DNA 檢測結果由陰性轉為陽性時，提示病毒已發生變異，應結合具體病情重新選擇抗病毒藥物。
