腸道感染病毒的分離鑒定
簡介
病毒分離是分子檢測技術發明之前，用于EV檢測的基本實驗技術。大多數EV病毒可在多種人源或靈長類動物來源細胞系上進行增殖。但由于每種細胞系對不同EV的敏感性不同，沒有任何一種細胞系可以用于分離所有型別的EV。
一般通過增加使用具有不同分離譜的細胞系種類，來增加分離EV的敏感性。最為常用的細胞系有：人橫紋肌肉瘤細胞系（rhabdomyosarcoma，RD）、人喉癌上皮細胞系（human laryngeal epidermoid carcinoma，Hep-2）、 非洲綠猴腎細胞系（Vero）等。
轉基因表達人CD155的鼠源細胞系（L20B）可用于PV的篩選。某些型別的EV不易在細胞系上增殖（如柯薩奇病毒A組部分型別），可在乳鼠上進行分離和培養。
材料與儀器
器材：
①一次性無菌手套
②標本采集管
③棉簽拭子
④培養箱
試劑：
①材料：待采標本
②PBS緩沖液
③培養基
步驟
腸道感染病毒的分離鑒定基本步驟如下：
（一）分離培養
在敏感細胞系上，EV增殖后可導致細胞的裂解，出現典型的細胞病變效應。CPE大多可在接種后7天內出現，正常細胞形態發生改變：顯微鏡下細胞變圓、縮小、細胞核固縮、折光率增加、細胞變性。對于EV滴度較低的標本，或增殖速度較慢的EV型別，在接種后14天內也可出現明顯的CPE。
由于大多數細胞系不能夠連續維持14天，因進行EV分離時，一般需盲傳兩代，每代細胞維持7天。此外，一些型別的EV在某些細胞系上無明顯CPE，這時需要借助分子生物學方法確定EV是否分離成功。
某些標本中含有的細胞毒性物質可在首次接種后24小時內引起細胞毒性反應，導致細胞壞死、脫落。而細胞毒性反應有時不易與CPE進行區分，這時需要將第一代培養物凍化后，進行再次接種。再次接種后，由于細胞毒性物質被稀釋，可避免細胞毒性反應的出現。
（二）核酸檢測
反轉錄-聚合酶鏈反應，尤其是實時熒光RT-PCR（Real-time RT-PCR，rRT-PCR）具有快速、靈敏、特異的特點，被廣泛應用于EV的核酸檢測。EV基因組在5＇UTR較為保守，以此作為檢測靶基因的RT-PCR和rRT-PCR方法主要用于EV的定性檢測。而以VP1編碼區作為檢測靶基因的RT-PCR和rRT-PCR方法則可用于EV的檢測及型別鑒定。
由于不同型別間VP1編碼區核苷酸序列差異較大，且該區變異較大，因此對所有EV型別的檢測，則需針對不同分組EV甚至不同型別EV設計多對引物或探針。某些標本中含有的PCR反應抑制物，以及引物、探針與病毒基因的不匹配導致體外擴增失敗，都會導致假陰性結果的出現。
從病變部位或無菌部位分離到EV或檢測到EV核酸，即可確認EV為引起相應臨床癥狀的病原體。由于EV存在較大比例的亞臨床感染，感染后并不引起臨床癥狀。因此，從咽拭子或糞便和肛拭子中檢測到EV病毒或核酸后，還需結合流行病學數據和臨床表現進行具體分析，以確定EV是為致病病原。
（三）型別鑒定
根據基因特征和生物學特征，所有人EV屬于EV-A、EV-B、EV-C、EV-D共4個組。
結構蛋白（P1），尤其是VP1編碼序列與血清型的關聯具有高度一致性。基于VP1編碼序列的EV型別鑒定方法，為當前國際公認的EV分型和鑒定的分子生物學依據，原則如下：
①全長VP1編碼區核苷酸序列與原型株同源性＞75％（氨基酸序列同源性＞85％ ），且與其他血清型同源性＜70％ 表明與原型株為同一型別；②全長VP1編碼區核苷酸序列與原型株同源性＜70％ 表明為不同或新的型別；③全長VP1編碼區核苷酸序列與原型株同源性在70％ 和75％ 之間，則需要通過進一步分析其他特點進行定型。
（四）血清學檢測
恢復期血清特異中和抗體的4倍或4倍以上升高可作為EV感染的血清學診斷依據。但某些EV感染病例的恢復期中和抗體升高水平＜4倍，甚至低于急性期。可能是由于恢復期血清標本采集較遲。
急性期血清中特異性IgM抗體檢測，可用于病毒感染的血清學診斷。EV存在較大比例亞臨床感染。因此，經血清學檢測證實的EV急性感染，是否是引起相應臨床表現的原因，還需結合流行病學數據和臨床表現進行具體分析。
注意事項
1．柯薩奇病毒：病毒分離、普通RT-PCR、熒光定量RT-PCR均是實驗室常用的柯薩奇病毒的檢測方法，中和試驗因操作較為復雜多數實驗室已不采用。
值得注意的是，柯薩奇病毒A組多數型別的毒株不能在培養的細胞中生長，但近年研究報道，A組的一些病毒可以在人橫紋肌肉瘤細胞系細胞上生長，并產生可見的細胞病變效應如CA-V6、CV-A10、CVA-16等。某些不易在細胞系上增殖的CV-A組病毒（CV-A19等），則可在乳鼠上進行分離和培養。而CV-B組病毒則大多數可以在細胞上培養，人喉癌上皮細胞系可提高CV-B組病毒的分離敏感性。
2．EV-A71：比較容易通過細胞培養分離到。HFMD病例皰疹液中分離到病毒或檢測到病毒核酸，腦炎、腦膜炎病例腦脊液中檢測到病毒或病毒核酸，即可確認EV-A71為致病病原。值得注意的是，EV-A71引起的腦炎及腦干腦炎患者的腦脊液中很少檢測到EV-A71病毒顆粒或核酸。
患者或無癥狀感染者的急性期咽拭子、糞便和肛拭子也是EV-A71病原學檢測的適宜標本類型，一般用于確定導致人群疾病暴發或流行的病原。從單個患者咽拭子、糞便或肛拭子中檢測到EV-A71，還需結合臨床和流行病學數據以確定EV-A71是否為引起臨床疾病的病原。
3．EV-D70：感染后較少從呼吸道和糞便標本中檢測到EV-D70，患者急性期結膜拭子為病原學診斷的理想標本類型。EV-D70可在細胞上進行分離培養，但標本中病毒核酸的直接檢測有助于提高檢測陽性率。
4．EV-D68：在體外細胞中增殖較困難，且其最適培養溫度為33 ℃，低于大多EV的最培養溫度（36 ℃）。呼吸道標本中病毒核酸的直接檢測有助于EV-D68的檢出。
