逆轉錄病毒感染懸浮細胞（上清感染）

原理

逆轉錄病毒（Retrovirus） 來源于可感染人和小鼠細胞的 Moloney 鼠白血病病毒（Mo-MLV），和慢病毒一樣是一種 RNA 病毒。這類病毒可通過逆轉錄成為原病毒，然后整合在宿主的基因組中，隨著細胞分裂可以穩定的遺傳下去。因此。逆轉錄病毒適合介導外源基因在宿主細胞中長期穩定表達。

用途

用于構建穩定細胞系；高效感染免疫系統來源的可分裂型細胞。

材料與儀器

無菌 1 × PBS，293T 細胞，鼠源 CD8+T 細胞，opti-mem 培養基，轉染試劑（Lipofectamine3000 等），逆轉錄病毒質粒，聚凝胺（Poly brene）， 細胞培養箱，細胞計數器等。

步驟

（1）293T 細胞轉染（產病毒，病毒包裝）

Day1：取對數生長期的 293T 細胞按照 10 × 106 的細胞數鋪入 10 cm 的培養皿中，該細胞于第二天能長至 90% 即可進行轉染。

Day2：根據轉染試劑說明書，分別用 opti-mem 培養基孵育質粒和轉染試劑若干分鐘后，輕柔混勻，逐滴加入至 293T 細胞中。

Day4：收集培養第 48 h 的 293T 細胞病毒上清液，用于感染 T 細胞（詳情見步驟 2），并更換新鮮培養基培養 293T。

Day5：收集培養第 72 h 的 293T 細胞病毒上清液，用于感染（詳見步驟 2）

（2）感染 CD8+T 細胞（第一次感染）

以 CD8+T 細胞為例：

Day3：通過細胞計數，按 1 × 106/孔的細胞數鋪入 48 孔板，每孔加入 1 ml 的 T 細胞培養基（加入 IL-2 細胞因子及 OVA 蛋白肽，用于刺激細胞），激活 CD8+T 細胞。

Day4：收集 48 h 的病毒上清液并離心（600 g，4 ℃，15 min），離心后，將上清液經 0.45 μm 濾器過濾轉移至新的離心管中，備用。觀察 CD8+T 細胞刺激情況，并棄去約 800 μl 培養基。每孔加入 1 ml 離心后的病毒上清液（加入 0.6 μl Poly brene/ml），并輕柔混勻每孔細胞。封板，2 200 rpm，37 ℃ 離心 2 小時，放入培養箱靜置 4 小時。4 小時后，棄病毒上清 800 μL，加入 T 細胞培養基 1 ml；封板，2 200 rpm，37 ℃ 離心 5 分鐘；棄上層培養基 800 μL，加入 T 細胞培養基至 1 ml，放入培養箱培養。  

（3）二次感染 CD8+T 細胞

收集 72 h 的病毒上清液并離心（600 g，4 ℃，5 min），對于 CD8+T 細胞，棄去 800 μl 培養基，加入 1 ml 離心后的病毒上清液，封板，2 200 rpm，37 ℃ 離心 2 小時，放入培養箱靜置 4 小時。具體流程同第一次感染一樣，見步驟（2）。

（4）檢測 CD8+T 細胞感染效率

取感染后 3 天的 CD8+T 細胞若干，根據質粒的標簽，進行流式染色或者 Western blot 效率驗證。

注意事項

1、293T 細胞不能鋪得太稀或者太滿，確保 24 h 內進行轉染，否則產病毒顆粒效率低，導致感染效率低。

2、293T 包病毒的第 48 h 觀察培養基顏色是否為橙紅色，若出現黃色或者金黃，說明 293T 狀態不行，或者鋪板時候細胞太多了。出現該情況不建議再進行感染，放棄本次實驗。

3、收集 72 h 病毒后，可取部分 293T 細胞進行轉染效率驗證。

常見問題

1、293T 細胞鋪得過稀或過多，根據實驗室摸索，按 10-12 × 106 的細胞數鋪入 10 cm 大皿，第二天能達到 90%。

2、感染效率低或者沒感染進去（排除以上注意事項外，可以考慮濃縮感染）

3、避免轉染以及感染過程的無菌操作避免污染。