單層細(xì)胞的胰蛋白酶處理
原理
下述方案描述的是釆用胰蛋白酶處理細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞的傳代或收集。維持細(xì)胞系的方法通常為每周傳代一次，在傳代的前一天換培養(yǎng)液；但是某些細(xì)胞系需要更頻繁的傳代。每種細(xì)胞系應(yīng)單獨(dú)傳代以免細(xì)胞系交叉污染。超凈工作臺(tái)內(nèi)不能同時(shí)放置個(gè)以上細(xì)胞系。
材料與儀器
步驟
1) 吸干培養(yǎng)單層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液。
2) 加入 0.05% 胰蛋白酶工作液（T-25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入 1 ml；T-75 細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入 3 ml)。
無菌的 10x 或 1x 胰蛋白酶/EDTA 工作液可從 Life Technologies 購買或按照下列配方配制：
胰蛋白酶 1x 工作液（0.05%)
胰蛋白酶/EDTA 10x 儲(chǔ)存液 100 ml
NaCl 7.1g
KCl 0.4 g
葡萄糖 1.0 g
NaHCO3 0.35 g
1% 酚紅 1.0ml
H2O 900 ml
調(diào)節(jié) pH 至 7.2
小心：KCl, 酚紅
胰蛋白酶/EDTA 10X 儲(chǔ)存液
胰蛋白酶（1:250) 5.0 g
EDTA?四鈉鹽 2.0 g
NaCl 0.85 g
H2O 100 ml
-20°C 儲(chǔ)存胰蛋白酶/EDTA10x 儲(chǔ)存液和 1x 工作液。小量分裝物可置 4°C 保存 1~2周。胰蛋白酶放置于 37°C 的時(shí)間應(yīng)盡可能縮短以免胰蛋白酶降解、酶活性下降，
3) 快速地前后旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶 4~5 次以便胰蛋白酶包被所有瓶內(nèi)細(xì)胞，并且痕量的培養(yǎng)液及血清得到稀釋。
4) 檢查細(xì)胞，不要待細(xì)胞脫落后才吸除胰蛋白酶工作液。
5) 另加 1~3 ml 胰蛋白酶工作液，再旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶 4-5 次。
6) 注意在細(xì)胞尚未脫落前吸除胰蛋內(nèi)酶工作液。
7) 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶蓋松松擰上后置細(xì)胞培養(yǎng)瓶于 37°C 培養(yǎng)箱中 2~5 分鐘。
8) 用手輕拍細(xì)胞培養(yǎng)瓶使得瓶內(nèi)的少量液體能夠帶下已經(jīng)要脫壁的細(xì)胞，檢查細(xì)胞脫落情況。苦無細(xì)胞脫落將細(xì)胞培養(yǎng)瓶再放冋 37°C 培養(yǎng)箱中孵育數(shù)分鐘。繼續(xù)輕拍細(xì)胞培養(yǎng)瓶直至細(xì)胞完全脫落。
9) 再懸細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)（2~5 ml/T-25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶)。
10) 輕輕吹打細(xì)胞使得團(tuán)狀細(xì)胞分散，以需要的細(xì)胞密度接種細(xì)胞。
注意事項(xiàng)
? 如果采用含有 EDTA 螯合劑的溶液作為預(yù)洗液，該傳代方案中胰蛋白酶的用量可減少。在此種情況下，步驟 2 可作修改，因?yàn)椴捎貌缓鹊鞍酌傅念A(yù)洗液。
預(yù)洗液
EDTA. 四鈉鹽 2.0 g
NaCl 8.0 g
KCl 0.4 g
葡萄糖 1.0g
NaHCO3 0.35 g
1% 酚紅 1 ml
H2O 900 ml
調(diào)節(jié) pH 至 7.2
? 對于對胰蛋白酶不很敏感的細(xì)胞系，下面的快速胰蛋白酶處理方案可供選擇
a. 用 PBS 洗滌單層細(xì)胞。
b. 加人足夠量的 lx 胰蛋白酶工作液以覆蓋所有細(xì)胞，37°C 孵育 5 分鐘。
c. 檢查細(xì)胞脫落情況，吸取胰蛋白酶工作液屮的細(xì)胞，用培養(yǎng)液稀釋至欲接種的細(xì)胞數(shù)。
