自然殺傷細(xì)胞（NK）和淋巴因子激活殺傷細(xì)胞（LAK）的殺傷功能

原理

NK細(xì)胞存在于人或動物外周血、脾臟、淋巴結(jié)和骨髓中，能殺傷某些腫瘤細(xì)胞、病毒感染靶細(xì)胞，無需抗原或有絲分裂原刺激，亦不依賴抗體或補體，在機(jī)體殺傷腫瘤、防御感染及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

　　
LAK是NK或T細(xì)胞在體外高劑量IL-2誘導(dǎo)下，獲得能殺傷NK抵抗的腫瘤細(xì)胞的功能，在過繼免疫治療腫瘤中已得到廣泛的應(yīng)用。

　　
通過將同位素51Cr摻入到NK的靶細(xì)胞K562（紅白細(xì)胞白血病細(xì)胞）或LAK的靶細(xì)胞LiBr（黑色素瘤細(xì)胞），按一定細(xì)胞比例與效應(yīng)細(xì)胞（NK或LAK）孵育4 小時，根據(jù)細(xì)胞上清中靶細(xì)胞被殺傷后所釋放的51Cr水平計算出殺傷細(xì)胞的殺傷活性。

材料與儀器

K562 LiBr
3H-TdR 51Cr FCS RPMI1640 rHu IL-2
培養(yǎng)瓶 培養(yǎng)板 CO2孵箱 液閃儀 計數(shù)儀

步驟

一、效應(yīng)細(xì)胞的制備

　　
NK功能效應(yīng)細(xì)胞可取靜止的PBMC，或經(jīng)不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)的PBMC。

　　
LAK功能的效應(yīng)細(xì)胞通常將PBMC或腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）或體液（癌性胸腹水）中純化的淋巴細(xì)胞（1×106 /ml）在含有高劑量IL-2（200～1000 μ/ml）的10 ％FCS RPMI1640 誘導(dǎo)2～5 天而成。

　　
二、殺傷試驗

主要有4 h 51Cr釋放法和3H-TdR釋放法，前者要求51Cr質(zhì)量好，同位素半衰期較短，操作所需時間短；后者需要無菌操作，所需時間較長。

　　
1.  51Cr 4 小時釋放試驗

　　　　　　　　　
（1）收獲處于對數(shù)生長期的靶細(xì)胞（K562，LiBr等）洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106 /ml

（2）取1×106細(xì)胞（0.5 ml），加Na251CrO4 100 μci，37 ℃孵育2～3 h，每15 min輕輕振搖一次

（3）用10 ％FCS RPMI1640洗滌3 次，每次800 rpm，5 min

（4）重懸細(xì)胞濃度1×105 /ml

（5）96 孔V型或U型培養(yǎng)板中，每孔加100 μl（1×104細(xì)胞），每份3 個復(fù)孔

（6）每孔加入100 μl不同細(xì)胞濃度的效應(yīng)細(xì)胞，最大釋放組加入100 μl，1 ％TritonX-100；自然釋放組加100 μl完全培養(yǎng)基

（7）200 g 離心1 min，37 ℃、CO2孵箱 4 h，200 g 離心1 min

（8）每孔取出100 μl上清，γ計數(shù)儀上測定cpm值

　　
（9）計算
 

　　　　　　　　　　實驗組cpm-自然釋放cpm

特異性殺傷率（％）＝─────────────

　　　　　　　　　　最大釋放cpm-自然釋放cpm

　　
2.  3H-TdR釋放試驗

　　　　　　　　
（1）收獲處于對數(shù)生長期的靶細(xì)胞（K562、LiBr等）洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106 /ml，加3H-TdR 20 μci

（2）37 ℃孵育2～3 h

（3）用10 ％FCS RPMI1640洗滌3 次，每次800 rpm，5 min 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105 /ml

（4）96 孔U型或平底培養(yǎng)板中，每孔加100 μl（1×104細(xì)胞），每份3個復(fù)孔

（5）每孔加入100 μl不同細(xì)胞濃度的效應(yīng)細(xì)胞，最大釋放組加100 μl 1％TritonX-100，自然釋放組加100 μl完全培養(yǎng)基

（6）CO2孵箱培養(yǎng)18～24 h

（7）每孔吸出100 μl上清，加入胰蛋白酶（終濃度0.15 ％）和DNA酶（終濃度為0.0125 ％）

（8）繼續(xù)孵育30 min

（9）用細(xì)胞收集儀收獲于玻璃纖維紙上

（10）干燥后，移入液閃瓶中，加入1 ml閃爍液，β液閃儀中測cpm值

（11）計算
 

　　　　　　　　　　　 實驗組cpm

特異性釋放率（％）＝(1- ────── )×100％

　　　　　　　　　　　 對照組cpm

注意事項

1.  每次試驗最好取3～4 個不同效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比例，常用效靶比例為100∶1，50∶1，25∶1，12.5∶1。

　　
2.  誘導(dǎo)LAK細(xì)胞過程中要注意無菌操作。

　　
3.  避免同位素污染。

　　
4.  根據(jù)實驗需要，可采用純化的NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，用Percoll不連續(xù)密度梯度離心純化NK細(xì)胞。
 

（1）1個溶解單位（Lytic unit，LU）為一定效應(yīng)細(xì)胞30 ％溶解（殺傷）5×103靶細(xì)胞（K562）的水平。

（2）如需進(jìn)一步純化LGL，可通過除去具有高親和性羊紅細(xì)胞受體細(xì)胞（T細(xì)胞），因為NK細(xì)胞只具有低親和性的綿羊紅細(xì)胞受體（ER）。具體方法是將Percoll分離的位于第2梯度的細(xì)胞洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106 /ml，移入試管，加入2 mlFCS和2 ml 1×108 /ml SRBC，100 g離心5 min，29 ℃孵育1 h，輕輕重懸細(xì)胞，疊加于3 ml Ficoll上，400 g室溫下離心30 min界面不形成花環(huán)的細(xì)胞即為LGL，純度可>90％。

　　
（3）在用PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行NK活性測定時，如想除去PBMC懸液中混雜的紅細(xì)胞，可用蒸餾水低滲的方法除去紅細(xì)胞，而不用NH4Cl方法，因為后者可降低NK功能。

　　
（4）在小鼠NK實驗中必須注意小鼠的品系和周齡，不同小鼠系NK活性有明顯的差別
 

（5）3周以內(nèi)或超過3個月以上小鼠的NK水平一般很低。