淋巴細(xì)胞增殖功能的測定實(shí)驗(yàn)

原理

T細(xì)胞、B細(xì)胞表面具有識(shí)別抗原的受體和有絲分裂原受體，在特異性抗原刺激下可使相應(yīng)淋巴細(xì)胞克隆發(fā)生增殖。植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA），抗CD2、抗CD3 McAb作為多克隆刺激劑可選擇性地刺激T細(xì)胞增殖；而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌體（SAC）、脂多糖（LPS，對(duì)小鼠有作用）則刺激B細(xì)胞發(fā)生增殖；美洲商陸（PWM）、腫瘤刺激劑PMA對(duì)T、B細(xì)胞的增殖均有刺激作用。最近發(fā)現(xiàn)，integrin家族中VLA組中某些受體與相應(yīng)配體結(jié)合后也能活化T細(xì)胞。目前臨床上最常選用PHA刺激PBMC，根據(jù)形態(tài)學(xué)或氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入率測定T細(xì)胞的增殖水平。

材料與儀器

PBMC
閃爍液 RPMI1640 CO2孵箱
細(xì)胞收集儀 β液閃儀

步驟

1.  無菌從肝素抗凝血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）洗滌后用10％FCS RPMI1640調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1～2x106/ml　　　　　

2.  加入96 孔培養(yǎng)板中，1～2x105 細(xì)胞/100 ul/孔，每組設(shè)3孔。加入最適劑量PHA，100 ul/孔，同時(shí)設(shè)不加PHA陰性對(duì)照。如觀察細(xì)胞因子（如IL-2）或其它刺激物（PMA）對(duì)增殖功能的調(diào)節(jié)作用，則根據(jù)加入因子的濃度而確定加入量，一般每孔最終體積為200 ul，37 ℃、5 ％ CO2孵育，66 h　　　　

3.  每孔加入0.5～1 uci　3H-TdR（50ul），繼續(xù)培養(yǎng)6～12h 　　　　　　　　　

4.  用DYQ-Ⅱ型多頭細(xì)胞收集儀收集樣品于"9999"型玻璃纖維濾紙上　　　　　　　　　　　

5.  烤干后β液閃儀計(jì)數(shù)　

6.  計(jì)算

（1）增殖水平直接用CPM值表示。

（2）也可用刺激指數(shù)（SI）表示

　　PHA（或?qū)嶒?yàn)組）cpm-機(jī)器本底

SI＝───────────────

　　陰性對(duì)照組cpm-機(jī)器本底

注意事項(xiàng)

1.  注意無菌操作。

2.  PHA、ConA、PWM、LPS等在正式實(shí)驗(yàn)前均需摸索最適劑量或亞適劑量。廠家和批號(hào)不同絲裂原作用常有很大差別，如Wellcome公司PHA終濃度最適劑量為1～3 ug/ml，而廣州醫(yī)工所PHA約為20～100 ug/ml。

3.  根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，對(duì)不同種（人、小鼠、大鼠、兔、狗等）不同來源淋巴細(xì)胞（胸腺、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃腺、外周血等）均應(yīng)進(jìn)行最適細(xì)胞濃度、圈養(yǎng)時(shí)間和刺激物濃度的摸索。

常見問題

來源：醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，主編金伯泉李恩善，第1 版，北京：世界圖書出版社，1990。