目的基因與載體DNA的連接
含有目的基因的DNA片段既不會自我復(fù)制也無法表達相應(yīng)的產(chǎn)物，必須同能夠自我復(fù)制的載體DNA分子（如質(zhì)粒及病毒分子等）結(jié)合后才能在宿主細胞內(nèi)隨著質(zhì)粒的復(fù)制而復(fù)制，并表達產(chǎn)物。
核酸限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶對外源DNA片段同載體分子連接起了關(guān)鍵作用。目的基因與載體的連接可分為互補黏性末端、非互補的黏性末端和平末端的連接。本節(jié)將只討論黏性末端DNA片段的連接。
大多數(shù)核酸限制性內(nèi)切酶切割DNA分子后都能形成具有1～4個單鏈核苷酸的黏性末端。若用同樣的限制酶切割載體和外源DNA，或是用能夠產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶切割時，所形成的DNA末端就能夠彼此退火，并被T連接酶共價地連接起來，形成重組DNA分子。當然，所選用的核酸酶對克隆載體分子最好只有一個識別位點，而且還應(yīng)位于非必要區(qū)段內(nèi)。
根據(jù)是否用一種或兩種不同的限制酶消化外源DNA和載體，黏性末端DNA片段的連接方法可分為插入式（單酶切）和取代式（雙酶切）兩種。
采用BamHI切割只有一個酶切位點的環(huán)狀質(zhì)粒時，環(huán)被打開成為線性分子，兩端都留下了由四個核苷酸組成的單鏈，這種末端稱為黏性末端。用BamHI切割含目的基因的DNA時，所獲得的目的基因?qū)⒕哂信c質(zhì)粒完全互補的兩個黏性末端。這樣，在T4連接酶的催化下，質(zhì)粒與目的基因的互補末端就能形成共價鍵，重組質(zhì)粒重新成為了環(huán)狀質(zhì)粒（見圖11.5.1）。但這種方法得到的外源DNA片段插入到質(zhì)粒中時，可能有兩種彼此相反的取向，這將增加篩選的難度。
根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的性質(zhì)，用兩種不同的限制酶同時消化一種特定的DNA分子，將形成兩個黏性末端不同的DNA片段。載體分子和待克隆的DNA分子，都是用同一對限制酶（HindⅢ和BamHI）切割，然后混合起來，那么載體分子和外源DNA片段將按唯一的一種取向退火形成重組DNA分子。這就是所謂的定向克隆技術(shù)，可以使外源DNA片段按一定的方向插入到載體分子中。
