神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)-酶消化法
原理
膠質(zhì)細(xì)胞具有復(fù)雜多樣的結(jié)構(gòu)和表達(dá)豐富的分泌產(chǎn)物，它含有大部分神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽、激素及神經(jīng)營養(yǎng)因子受體、離子通道、神經(jīng)活性氨基酸親和載體、細(xì)胞識(shí)別分子，并能分泌多種神經(jīng)活性物質(zhì)(生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子和細(xì)胞因子等)。
神經(jīng)細(xì)胞（神經(jīng)元）不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細(xì)胞因子時(shí)，可出現(xiàn)一定程度的分化，長出突起等現(xiàn)象，但很難使之增值。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。
材料與儀器
大鼠
MEM FBS 胰酶 EDTA D-Hanks’液
眼科剪 滴管 離心機(jī) 培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱
步驟
1. SD 大鼠經(jīng)低溫麻醉后以碘酒和75%乙醇消毒，無菌操作下，斷頭放入預(yù)冷的D-Hanks’液中，在解剖顯微鏡下取大腦皮層并除去腦膜。
2. 剪碎組織成1 mm3 大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入 37℃孵箱內(nèi)消化20 min，中間搖晃一次。
3. 隨后用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的 MEM＋10%FBS(Glial Medium，GM)的離心管內(nèi)終止消化液作用5 min。
4. 吸出組織轉(zhuǎn)移到另一支裝有冷的 GM 的離心管內(nèi)，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次，靜置后取上清并吸到另一支離心管內(nèi)。重復(fù)上述步驟 2～3 次。
5. 所得上清于800 rpm 離心5 min，棄上清，管內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)液并吹打成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度1.5×105/cm2 種入 25 cm2 培養(yǎng)瓶，放入孵箱培養(yǎng)。以后每隔2～3 d 進(jìn)行全量換液。
6. 搖床振搖分離星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞：培養(yǎng)至7～10 天，換液后放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出擰緊培養(yǎng)瓶蓋，于37℃恒溫?fù)u床上280 rpm 搖 動(dòng)18 h。此時(shí)寡突膠質(zhì)細(xì)胞 90%以上在培養(yǎng)懸液內(nèi)而與瓶底貼壁的星形膠質(zhì)細(xì)胞分離。
7. 分離培養(yǎng)懸液內(nèi)的少突膠質(zhì)細(xì)胞：吸出懸液至離心管內(nèi)950 rpm 離心10 min，棄上清后管內(nèi)加入新鮮GM，吹打成單細(xì)胞懸液，按1.5×105/cm2 種入預(yù)先用100 µg/L 多聚賴氨酸包被好的 35 mm 培養(yǎng)皿培養(yǎng)。24 h 后換成DF12＋N2 的無血清 培養(yǎng)液，此后每三天半量換液1 次。
8. 瓶底星形膠質(zhì)細(xì)胞的繼續(xù)培養(yǎng)：25 cm2 培養(yǎng)瓶內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞用D-Hanks’液洗2 次后常規(guī)傳代，以 1.5×105/cm2 種入預(yù)先用100 µg/L 多聚賴氨酸包被好的35 mm 培養(yǎng)皿培養(yǎng)。培養(yǎng)液為GM，每三天半量換液1 次。附GFAP鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞圖片。
注意事項(xiàng)
做原代混膠細(xì)胞，相對(duì)來說比較好養(yǎng)。
