小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗
原理
微核試驗是用于染色體損傷和干擾細(xì)胞有絲分裂的化學(xué)毒物的快速檢測方法。微核是指存在于細(xì)胞中主核之外的一種顆粒，大小相當(dāng)于細(xì)胞直徑的1/20～1/5，呈圓形或杏仁狀，其染色與細(xì)胞核一致，在間期細(xì)胞中可以出現(xiàn)一個或多個。一般認(rèn)為微核是細(xì)胞內(nèi)染色體斷裂或紡錘絲受影響而在細(xì)胞有絲分裂后期滯留在細(xì)胞核外的遺傳物質(zhì)。所以，微核試驗?zāi)軝z測化學(xué)毒物或物理因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的染色體完整性改變和染色體分離改變這兩種遺傳學(xué)終點。
微核可以出現(xiàn)在多種細(xì)胞中，但在有核細(xì)胞中較難與正常核的分葉及核突出物相區(qū)別。由于紅細(xì)胞在成熟之前最后一次分離后數(shù)小時可將主核排出，而仍保留微核于PCE細(xì)胞中，因此通常計數(shù)PCE細(xì)胞中的微核。
材料與儀器
小鼠
甲醇 甘油 小牛血清 生理鹽水 Giemsa儲備液
手術(shù)刀 手術(shù)剪 無齒鑷 小型彎止血鉗 臺式離心機(jī) 刻度離心管 玻璃蠟筆、玻璃染色缸 2帶油鏡頭顯微鏡 細(xì)胞計數(shù)器
步驟
1．試驗動物及處理
(1)動物選擇：一般常用的試驗動物為大、小鼠。以小鼠使用最為廣泛，要求體重18～20g，7~12周齡。每組小鼠數(shù)量10只，雌雄各半。
(2)染毒途徑：根據(jù)研究目的或受試化學(xué)毒物性質(zhì)的不同，可分別選用經(jīng)口、經(jīng)皮、經(jīng)呼吸道及注射等染毒途徑。但原則上應(yīng)盡可能采用與人體接觸化學(xué)毒物相同的途徑。
(3)染毒次數(shù)及取樣時間：研究證實化學(xué)毒物需在靶器官內(nèi)蓄積至一定的濃度才具有致突變作用。不同化學(xué)毒物誘發(fā)微核出現(xiàn)的高峰時間也不盡相同。波動范圍可以達(dá)到24～72h。這就要求在接觸化學(xué)毒物后設(shè)立不同的采樣時間點。考慮到以上兩方面的原因，建議采用多次染毒的方法。其中以4次染毒比較方便合理。即每天染毒一次，連續(xù)4天，第5天取樣。這樣，取樣一次就能覆蓋24～72h高峰，如果高峰延遲到96h也不會漏掉。
(4)劑量選擇：受試化學(xué)毒物的最大劑量除受溶解度大小所限外，應(yīng)達(dá)到最大耐受量。葉般情況下，應(yīng)設(shè)3～5個或更多劑量組，劑量覆蓋的范圍要達(dá)到3個數(shù)量級以上。同時還應(yīng)設(shè)立陽性對照組和陰性對照組。陽性對照組可用環(huán)磷酰胺(50~100mg／kg)或絲裂霉素C(10mg／kg)腹腔注射1次或2次。陰性對照組使用等體積的溶劑。
2．骨髓液的制備和涂片
試驗動物最后一次染毒后，按確定的時間用頸椎脫臼或麻醉，的方法將其處死，四肢固定于解剖板，將腹中線被毛浸濕，剖開胸腹部，取下胸骨，擦凈血污，剔去肌肉，剪去骨骺，用小型彎止血鉗將骨髓擠于有一滴小牛血清的清潔載玻片上，混合均勻后推片。也可在動物處死后，迅速用手術(shù)剪將其兩腿股骨取下，剔去肌肉，用生理鹽水洗去血污和碎肉，剪去兩端的骨骺，用帶針頭的2ml注射器吸取小牛血清，插人骨髓腔內(nèi)，將骨髓沖人離心管，然后用吸管吹打骨髓團(tuán)塊使其均勻，以1000r／min離心10min，棄去多余的上清液，留下約0.5ml與沉淀物混勻后，用滴管吸取并滴一滴在清潔的載玻片上，推片。陽性及陰性對照組按上述方法同時進(jìn)行處理。
3．固定
將推好晾干的骨髓片放人染色缸中，用甲醇溶液固定15min，取出晾干。不能及時染色的涂片也應(yīng)固定后保存。
4．染色
將固定晾干后的涂片，用新鮮配制．的Giemsa應(yīng)用液(Giemsa儲備液l份加pH6.8的磷酸鹽緩沖液9份)染色10~15min，然后沖洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。
5．觀察計數(shù)
先在低倍鏡下進(jìn)行觀察，選擇分布均勻，染色較好的區(qū)域，再在油鏡下觀察計數(shù)，PCE細(xì)胞呈灰藍(lán)色，正染紅細(xì)胞(NCE)呈橘黃色。細(xì)胞中含有的微核多數(shù)呈圓形，邊緣光滑整齊，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色。一個細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)一個或多個微核。計數(shù)1000個PCE中含微核的PCE數(shù)，并且計數(shù)200個細(xì)胞中PCE與NCE的比值。
注意事項
本試驗中只計數(shù)PCE中的微核，微核率以千分率表示。每只動物為一觀察單位。每組的雌、雄動物分別計算微核PCE的均值。雌、雄動物之間無明顯的性別差異時可合并計算結(jié)果，否則應(yīng)分別進(jìn)行計算；正常的PCE／NCE比值約為1(正常范圍為0.6～1.2)。如比值<0.1，則表示PCE形成受到嚴(yán)重抑制，受試化學(xué)毒物的劑量過大，試驗結(jié)果不可靠。陰性對照組和陽性對照組的微核發(fā)生率，應(yīng)與試驗所用動物種屬及品系的文獻(xiàn)報道結(jié)果或者是與研究的歷史數(shù)據(jù)相一致。
常見問題
微核試驗所獲數(shù)據(jù)資料的頻數(shù)分布尚無定論，多種統(tǒng)計學(xué)方法(如泊松分布、二項分布、X2檢驗等)均有人用于試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析。該試驗的關(guān)鍵步驟是制作良好的骨髓涂片及優(yōu)質(zhì)的染色。
