工具藥、融合蛋白等示蹤自噬形成

原理

正常培養的細胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對自噬進行人工干預和調節，包括自噬誘導劑、自噬抑制劑等工具藥，以及反義RNA干擾技術（Knockdown）、突變株篩選、外源基因導入等。并通過熒光顯微鏡或者Western Blot等技術來檢測。

材料與儀器

細胞
自噬誘導劑自噬抑制劑單丹磺酰尸胺（MDC） 0.1%SDS
熒光顯微鏡細胞爬片

步驟

一、正常培養的細胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對自噬進行人工干預和調節

二、細胞經誘導或抑制后，需對自噬過程進行觀察和檢測，常用的策略和技術有：

1、觀察自噬體的形成；

2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成；

3、利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬形成；

4、檢測長壽蛋白的批量降解；

5、MDC（Monodansylcadaverine，單丹磺酰尸胺）染色；

6、CellTrackerTM Green染色：主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的；

注意事項

一、自噬誘導劑

1.Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內質網應激

2.Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase 抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）

3.Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓

4.N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑

5.Rapamycin：mTOR抑制劑

6.Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑

二、自噬抑制劑

1.3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制劑

2.Bafilomycin A1：質子泵抑制劑

3.Hydroxychloroquine（羥氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶體腔堿化劑）

除了選用上述工具藥外，一般還需結合遺傳學技術對自噬相關基因進行干預：包括反義RNA干擾技術（Knockdown）、突變株篩選、外源基因導入等。

常見問題

在研究自噬相關蛋白時，需對其進行定位。由于自噬體與溶酶體、線粒體、內質網、高爾基體關系密切，為了區別，常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位：

Lamp-2：溶酶體膜蛋白，可用于監測自噬體與溶酶體融合。

LysoTrackerTM 探針：有紅或藍色可選，顯示所有酸性液泡。

pDsRed2-mito：載體，轉染后表達一個融合蛋白（紅色熒光蛋白+線粒體基質定位信號），可用來檢測線粒體被自噬掉的程度（Mitophagy）。

MitoTraker探針：特異性顯示活的線粒體，熒光在經過固定后還能保留。

Hsp60：定位與線粒體基質，細胞死亡時不會被釋放。

Calreticulin（鈣網織蛋白）：內質網腔

（注意：這些蛋白均為胞漿蛋白，爬片或胰酶消化的細胞在做免疫熒光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS處理。）