染色體提前凝集標本的制備
簡介
由于有絲分裂期成熟促進因子(maturation promoting factor,MPF)的活性很高，用 M 期細胞和間期細胞進行融合，可以使間期細胞出現類似于有絲分裂期的形態變化:染色質凝集、核膜崩解、核仁消失等.這種經過誘導而在間期細胞中形成的染色體稱為提前凝集染色體或早熟凝集染色體(prematurely condensed chromosome,PCC)。
原理
染色體提前凝集標本的制備原理是將 M 期細胞和 G1 期細胞融合，則 G1 期細胞染色質就凝集為光學顯微鏡下可見的單股細而長的提前凝集染色體，即 G1-PCC。其染色體的長短和粗細與細胞在 G1 期所處的位置緊密相關：早 G1 期的染色體短而粗，晚 G1 期則細而長。S 期細胞正處于 DNA 復制階段，大量的復制單位不同時啟動復制，所以正在復制的染色質高度解螺旋，光學顯微鏡下不可見，而只能看到尚未進行復制或復制后又重新凝集的部分。M 期細胞誘導 S 期細胞的染色質凝集呈粉末狀或粉碎顆粒狀，在電鏡下可見：顆粒狀是染色質螺旋化程度高的部位，顆粒之間由纖細的染色質絲相連，并且可根據顆粒是單股或雙股區分出是復制前還是復制后的染色質，從而斷定細胞是處于早 S 期還是晚 S 期。G2-PCC 的形態已接近于 M 期的染色體，只是螺旋化程度較低，所以其染色淺、細長、姐妹染色單體之間緊靠一起。
用途
染色體提前凝集標本常用于細胞周期分析、正常細胞和腫瘤細胞染色體的微細結構的研究、多種因素作用致染色體損傷及修復效應的研究、血液病的診斷及預后等臨床實踐方面。
材料與儀器
器材:
① 普通光學顯微鏡
② 普通低速離心機
③ CO2 恒溫培養箱
④ 超凈工作臺
⑤ 5 ml 刻度離心管、一次性滴管、載玻片、蓋玻片、細胞計數板試劑
材料:
① HeLa 細胞
② PEG(M, = 4000)(50%)
③ RPMI-1640 培養液
④ 小牛血清
⑤ Hanks 液
⑥ 秋水仙素(10 μg/ml)
⑦ 胰蛋白酶(0.25%)
⑧ KC1(0.075 mol/L)
⑨ 甲醇-冰醋酸(3:1)(新鮮配制)
⑩ 吉姆薩染液
步驟
染色體提前凝集標本的制備基本過程可分為如下幾步:
1.M 期細胞的準備
(1)按一般方法傳代細胞。
(2)在培養 2~3 d、細胞生長旺盛并處于對數生長期時，加入秋水仙素（終濃度為 0.2~0.5 μg/ml），繼續在 CO2 恒溫培養箱中培養 3~4 h。
(3)輕輕傾去培養液，用 5 ml Hanks 液清洗細胞 2 次，棄去死細胞、細胞碎片和 Hanks 液。
(4)加入 5 ml Hanks 液，反復振搖培養瓶 3~5 min，或用吸管反復輕輕吹打細胞層。由于 M 期細胞呈球形，與瓶壁的接觸面積變小，易脫落而懸浮于培養液中。把細胞懸液轉移人 5 ml 刻度離心管中，計數備用。
2.間期細胞的準備
在上述收集過 M 期細胞的貼壁細胞中，加入終濃度為 0.25% 的胰蛋白酶溶液，消化 2~3 min，棄去消化液,加入 5 ml Hanks 液，用吸管反復吹打細胞層，把細胞懸液轉移入 5 ml 刻度離心管中，計數備用。
3.細胞融合
(1)將 M 期細胞和間期細胞按 1:1 比例（各約 106 個）混合于 5 ml 離心管中，800 g 離心 5 min，棄上清液。用 5 ml Hanks 液重懸洗滌、離心 2 次，盡可能地棄盡上清液。
(2)輕彈管底使沉淀松動，置 37℃（39 ℃ 左右更佳）水浴中預溫，緩慢逐滴加入 0.5~1 ml 37 ℃ 預溫的 50% PEG 溶液，邊加邊用吸管輕輕混勻（也可在滴加過程中先輕搖混勻最后再用吸管輕輕吹打混勻）。37 ℃ 靜置 1 min。
(3)加入 5 ml 無血清的 RPMI-1640 培養液（開始 1 ml 應緩慢逐滴加入），混勻（稀釋以終止 PEG 溶液的作用）。800 g 離心 5 min（離心前可在 37 ℃ 靜置 5~10 min），棄上清液。
(4)加入含小牛血清的 RPMI-1640 生長培養液，輕輕吹打混勻使細胞懸浮。37 ℃、5% CO2 培養 30~60 min.
4.制片
將上述細胞取出，800 g 離心 8 min，棄上清液。按常規方法制備染色體標本。經吉姆薩染液染色后觀察結果。
注意事項
(1)為了保證融合率，加 PEG 之前應盡可能地棄盡上清液；在滴加 50%PEG 時，應緩慢、逐滴加入，滴加過程注意要溫和混勻。
(2)在加完 PEG 并靜置 1 min 后，用培養液稀釋 10 倍，手法要輕。在 37 ℃ 培養較長時間(30~60 min)，一般可獲得高比例的 PCC。
