細(xì)胞粘附檢測(cè)－熒光法

簡介

細(xì)胞粘附是指細(xì)胞通過細(xì)胞表面的特化分子相互作用并附著到鄰近細(xì)胞的過程。可分為細(xì)胞直接接觸和通過細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生連接。

在細(xì)胞增殖、維持活性、分化和遷移中具有關(guān)鍵作用。細(xì)胞黏附熒光法是通過活細(xì)胞熒光探針染色黏附的活細(xì)胞數(shù)量來反應(yīng)細(xì)胞的黏附能力變化。

用途

通過細(xì)胞粘附研究可能找到治療癌癥的潛在治療靶點(diǎn)。

材料與儀器

試劑耗材：

① 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

② PBS

③ 1% BSA

儀器設(shè)備：

① 熒光酶標(biāo)儀

② 離心機(jī)

③ 移液器

④ 冰箱

⑤ 冰盒

⑥ 離心管

⑦ 吸頭

⑧ 鈣黃綠素試劑

步驟

實(shí)驗(yàn)的具體步驟：細(xì)胞接種及處理、黏附率檢測(cè)。

1、細(xì)胞接種

（1）將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞進(jìn)行處理，用胰酶消化后，用 PBS 洗滌后，收集到離心管中 1 000 rpm、5 min 并用相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，制成細(xì)胞懸液。

（2）按每孔 5 × 104 細(xì)胞接種 96 孔板（具體細(xì)胞接種數(shù)目依據(jù)細(xì)胞特性和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行調(diào)整，檢測(cè)前對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量達(dá)到 80~90%），建議設(shè)置 3~5 個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)立對(duì)照組、藥物處理組、空白對(duì)照組。對(duì)照組即溶劑處理組，空白對(duì)照組為不含細(xì)胞且更換正常細(xì)胞培養(yǎng)基，其他處理一致。

（3）將細(xì)胞放 37 ℃ 培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng) 24 h，依照實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆謩e處理對(duì)照組和藥物處理組，后進(jìn)行熒光染色觀察不同組別熒光強(qiáng)度。

2、粘附率檢測(cè)

（1）工作液的配制，從冰箱取出熒光染色（鈣黃綠素）試劑，加入 DMSO 制成儲(chǔ)存液。并按照所測(cè)樣品用量加入粘附測(cè)定緩沖液制成工作液，儲(chǔ)存液可以 -20 ℃ 下保存。

（2）取出細(xì)胞培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)基。并用 PBS 洗滌 2~3 次后，加入每孔加入 100 μL 鈣黃綠素工作溶液，孵育培養(yǎng) 20~30 min 后，去除上清液后，加入 PBS 清洗細(xì)胞。

（3）用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果。最大激發(fā)波長 488 nm，最大發(fā)射波長分別為 520 nm。

（4）細(xì)胞粘附率計(jì)算。將各測(cè)試孔的熒光強(qiáng)度值減去空白孔（未加細(xì)胞孔）熒光強(qiáng)度值。各重復(fù)孔的熒光強(qiáng)度值取平均數(shù)。

細(xì)胞粘附率 =（（F 藥物處理細(xì)胞 - F 空白）/（F 對(duì)照細(xì)胞 - F 空白））× 100%

常見問題

（1）離心細(xì)胞速度不能太快，還有吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕柔，避免多次反復(fù)的激烈吹打，同時(shí)不用渦旋振蕩器，減少細(xì)胞受損風(fēng)險(xiǎn)。

（2）染色培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類的不同和每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少而異。

（3）忘記封閉，或封閉時(shí)間較短，使實(shí)驗(yàn)受抗體非特異性結(jié)合的影響。

（4）若細(xì)胞在染色后于不含染料的培養(yǎng)基中孵育，熒光信號(hào)會(huì)衰減。

（5）在孵育抗體的時(shí)候忘記避光。

（6）鈣黃綠素母液可以進(jìn)行小量分裝，每次使用一管，試劑于 -20 ℃ 避光凍存，避免反復(fù)凍融。

（7）鈣黃綠素工作液要現(xiàn)配現(xiàn)用。

（8）注意洗滌細(xì)胞時(shí)用 PBS 進(jìn)行反復(fù)洗滌，減少培養(yǎng)基中血清的影響。