免疫熒光技術

簡介

免疫熒光技術是指將抗原抗體反應和熒光標記技術聯合使用以鑒定陽性雜交瘤細胞株的方法。

原理

根據抗原抗體反應的原理，先固定表達抗原的細胞，而后加入雜交瘤上清液（一抗），最后加入 FITC-二抗檢查細胞內外是否有單克隆抗體結合。

若為陽性雜交瘤細胞株，則可在細胞上形成具有熒光素的抗原抗體復合物。熒光素受激發光照射會發出明亮的熒光，用熒光顯微鏡觀察可以看到是否有熒光存在以及熒光強度，從而確定雜交瘤細胞株是否為陽性，并進行定量。

用途

陽性雜交瘤細胞株篩選等。

材料與儀器

儀器：熒光顯微鏡、移液器；

試劑：1×PBS、Tris-HCl 緩沖液、50 mM 氯化銨（用 PBS 配制）、含 1% BSA 的 PBS 溶液（簡稱封閉液）、細胞、90% 甘油（用 Tris-HCl 緩沖液配制）、透明指甲油、4% 的多聚甲醛（用 PBS 配制，PH 7.4）、一抗（純化的單克隆抗體或雜交瘤細胞上清液）、二抗（FITC-抗鼠 IgG+IgM）、Triton X-100；

耗材：Lab-Tek II 腔室載玻片系統或 96 孔板、濾紙、移液槍頭、離心管。

步驟

使用免疫熒光技術篩選陽性雜交瘤細胞株的步驟如下：

1、在腔室載玻片上或 96 孔板中培養細胞至合適的密度（約 60%~80%），棄去上清液，每個腔室或培養孔中加入 1×PBS 溶液潤洗 2 次。

2、棄去 PBS 溶液，加入含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液固定細胞，室溫下孵育 15~30 min。

3、棄去固定液，用含 50 mM 氯化銨的 PBS 溶液潤洗細胞 3 次。

4、棄去氯化銨溶液，用 1×PBS 溶液潤洗細胞兩次。

5、棄去 PBS 溶液，加入冰上預冷的含 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液，完全浸沒細胞。置于 20 ℃ 中孵育 3 min。

6、去除液體，用 1×PBS 溶液潤洗細胞 3 次，每次 5 分鐘。

7、棄去 PBS 溶液，加入含 1% BSA 的 PBS 溶液封閉 30 min。

8、棄去封閉液，加入用封閉液稀釋的一抗，沒過載玻片即可。室溫下濕盒中孵育 1 小時，或 4 ℃ 孵育過夜。

9、棄去一抗，用 1×PBS 潤洗 3 次，每次 5 分鐘。

10、加入二抗（FITC-抗鼠 IgG+IgM，用封閉液 1:100 稀釋），在室溫下避光孵育 1 小時。

11、棄去二抗，用 1×PBS 潤洗 3 次，每次 5 分鐘。

12、棄去 PBS，加入含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液固定尚未被固定的細胞，室溫下孵育 15~30 min。

13、用蒸餾 H2O 潤洗細胞。

14、若用 96 孔板，直接在顯微鏡下觀察即可，觀察完丟棄即可；若用 Lab-Tek II 腔室載玻片系統，則將載玻片夾在兩片濾紙中間，溫和地吸去多余的水分。

15、在載玻片上滴加一滴含 90% 甘油的 Tris-HCl 溶液，蓋上蓋玻片。在蓋玻片邊緣涂上一層透明指甲油起到密封的作用。

16、在熒光顯微鏡下觀察，觀察完的載玻片可以平放在不透光的玻片盒中，于 4 ℃ 或 20 ℃ 保存。

注意事項

1. Lab-Tek II 腔室載玻片系統相較 96 孔板更為優越，在前期實驗中，每個腔室彼此分隔，可以同時檢測不同的雜交瘤細胞株，后續又可以取下隔板，一次操作，搞定所有細胞株，相較 96 孔板操作更簡單。

2. 48 孔板相較 96 孔板，重復效果更好。

3. 在培養細胞時，使用牛血清會導致熒光背景較高，因此可以用低 Ig 含量的胎牛血清或無血清培養基進行細胞培養。

4. 14 和 15 步選做，通常固定一次即可。

5. 二抗孵育開始注意避光，防止熒光猝滅。

6. 清洗時注意不要使液體直接沖擊樣品，防止樣品脫落或碎裂。

常見問題

1. 背景高

解決辦法：

① 在培養細胞時，將常規的牛血清換成低 Ig 含量的胎牛血清或無血清培養基；

② 延長封閉時間或增加一抗二抗后的洗滌時間，保證封閉和洗滌的較為充分，盡量把液體完全棄除。

③ 操作過程中，速度要快，以免細胞干掉。

2. 無熒光

解決辦法：

① 設置陽性對照，排除抗體失效、錯加或漏加的可能；

② 細胞是否污染。