細(xì)胞球狀體形成實(shí)驗(yàn)

簡介

腫瘤干細(xì)胞 （CSC） 是指腫瘤內(nèi)不僅具有自我更新能力還擁有較強(qiáng)侵襲遷移能力的那一小部分細(xì)胞，常常在化療治療后驅(qū)動腫瘤惡變和復(fù)發(fā)，與腫瘤的存活、增殖、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

傳統(tǒng)上，腫瘤干細(xì)胞會從癌細(xì)胞系和腫瘤活檢組織中分離出來，并在三維腫瘤球狀體懸浮培養(yǎng)物中生長，成球能力是腫瘤干細(xì)胞體外鑒定的一個重要方法，目前腫瘤細(xì)胞的成球?qū)嶒?yàn)（成球大小及數(shù)目）是衡量腫瘤細(xì)胞干性的主要手段。判斷單個細(xì)胞在適宜的條件下自我更新的能力通常用細(xì)胞球形成的效率來表示。

用途

球狀體形成測定主要應(yīng)用在癌癥干細(xì)胞研究和人類腫瘤細(xì)胞的研究中。通過此方法可以評估各種不同的細(xì)胞表面標(biāo)志物和信號通路對腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞（CSC）表型的影響，同時此方法可有效的檢測惡性細(xì)胞、腫瘤發(fā)生以及評估癌細(xì)胞的耐藥性。

材料與儀器

癌細(xì)胞（本文以結(jié)直腸癌細(xì)胞為例）

RPMI 培養(yǎng)基、DMEM/F12 培養(yǎng)基

L-谷氨酰胺、抗生素（青霉素/鏈霉素）

EDTA 溶液、6/12/24/96 孔板、燒瓶

試管等

步驟

一、干細(xì)胞培養(yǎng)基的制備

1. 使用 DMEM/F-12 培養(yǎng)基。可選擇補(bǔ)充 1 U/ml 青霉素/鏈霉素。

2. 加 10 ng/ml 濃度的人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、10 ng/ml 濃度的人重組表皮生長因子（EGF）和 N-2（100 X）補(bǔ)充劑等生長因子。

二、球狀體形成

1. HCT116 細(xì)胞在 RPMI 培養(yǎng)基中生長，在組織培養(yǎng)瓶中添加 10% 滅活胎牛血清（FBS）和 2 mM L-谷氨酰胺。

2. 在 37 °C 和 5% CO2 的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每 3~4 天更換一次培養(yǎng)基。（本培養(yǎng)基不含青霉素/鏈霉素）。

3. 當(dāng)細(xì)胞融合 60~80%，抽吸培養(yǎng)基后用 3 ml 預(yù)熱無菌 PBS 洗滌 2 次。加入 2 ml 0.05% 胰蛋白酶乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，在 37 ℃ 培養(yǎng)箱中消化 5 分鐘。

4. 在每個培養(yǎng)瓶中加入 6 ml 全培養(yǎng)基中和胰蛋白酶，上下移動細(xì)胞以獲得單細(xì)胞懸浮液。將完整的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到 15 ml 標(biāo)記的 Falcon 試管中。

5. 在室溫下將細(xì)胞 350×g 離心 5 分鐘，抽吸上清，將微球重懸于 4~6 ml 無菌 PBS 中。

6. 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至每 2 ml 完整干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有 3000 個。

7. 精確計(jì)數(shù)后，取 200 μL 非血清培養(yǎng)基以 200 個細(xì)胞/孔密度加入 96 孔板，每組 10 孔。并在 37 °C和 5% CO2 的標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)細(xì)胞兩周。第 14 天觀察到具有剛性邊緣的結(jié)腸球。

8. 每 3~4 天更換一次新鮮制備的完整干細(xì)胞培養(yǎng)基。當(dāng)結(jié)腸球生長為漂浮的球形菌落時，更換培養(yǎng)基。

9. 使用熒光顯微鏡對每組隨機(jī)選取的 5 個區(qū)域進(jìn)行成像，觀察細(xì)胞成球情況并計(jì)算細(xì)胞成球效率，球體百分比按球體數(shù)/200 計(jì)算。

注意事項(xiàng)

添加生長因子時，應(yīng)在使用前添加生長因子。

常見問題

球體形成的第 5 步，混合細(xì)胞時容易產(chǎn)生氣泡，應(yīng)避免氣泡的產(chǎn)生。