顯色法

原理

血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（SGPT）能催化丙氨酸與酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸，丙酮酸在酸性條件下與2，4-二硝基苯肼可縮合成丙酮酸二硝基苯腙，該腙在堿性條件下呈現(xiàn)出橙紅色，呈色深淺符合比爾定律，在520 nm處有最大吸收。SGPT 在肝臟中含量最高，由于肝細(xì)胞損害，該酶逸出血液，可使 SGPT 含量明顯增高。因此測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性可作為肝中毒肝病的重要指標(biāo)。

材料與儀器

丙酮酸
丙酮 α-酮戊二酸 dl-丙氨酸 2 4-二硝基苯肼 氫氧化鈉
恒溫水浴鍋 722S分光光度計(jì) 吸量管 試管 試管架

步驟

溶液配制：
1. 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取22 mg純凈丙酮酸鈉，用pH 7.4磷酸緩沖液定容至100 ml。
2. SGPT底物溶液：準(zhǔn)確稱取α-酮戊二酸87.6 mg，dl-丙氨酸5.34g，先用90 ml 0.1  mol/L pH7.4的磷酸緩沖液溶解，然后用20%NaOH溶液調(diào)至pH7.4，再以上述磷酸緩沖液稀釋至300 ml，冰箱保存可用一周（加氯仿防腐）。
3. 0.1 mol/L pH7.4的磷酸緩沖液。
4. 2，4-二硝基苯肼溶液：稱取19.8 mg2，4-二硝基苯肼，置于100 ml容量瓶中，先用8 ml濃鹽酸溶解后，再加水稀釋至刻度。
5. 0.4  mol/L氫氧化鈉溶液。
操作步驟：
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取干燥潔凈試管6支，編號，按下表所示添加試劑。
 
 
向每管加0.5 ml2，4-二硝基苯肼，再保溫20 min，分別向各管加入0.4 mol/L氫氧化鈉溶液5 ml，室溫下靜置10 min后，用蒸餾水調(diào)零點(diǎn)，于520 nm處測光密度。以各管光密度減去空白管光密度為縱坐標(biāo)，丙酮酸微克數(shù)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2. SGPT活力測定：取潔凈干燥試管4支，即測定管、對照管各2支，按下表添加試劑。
 
 
各管反應(yīng)完畢，混勻，室溫下靜置10 min后，再以蒸餾水調(diào)零點(diǎn)測定光密度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得丙酮酸微克數(shù)，根據(jù)下式計(jì)算SGPT 的活力：SGPT 活力（單位）=（測定管微克數(shù)-對照管微克數(shù)）/2.5×0.1。

注意事項(xiàng)

1. 在呈色反應(yīng)中，2，4-二硝基苯肼可與有酮基的化合物作用形成苯腙，底物中α-酮戊二酸可與之發(fā)生反應(yīng)，生成α-酮戊二酸苯腙。故制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，需要加入一定量的底物以抵消α-酮戊二酸的影響。
2.在測定 SGPT 活力時(shí)，應(yīng)事先將底物、血清在37 ℃水浴中恒溫，然后在血清管中加入底物，準(zhǔn)時(shí)計(jì)時(shí)。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線上數(shù)值在20～100 U是準(zhǔn)確可靠的，超過200 U 時(shí)，需將樣品稀釋。
4.丙氨酸應(yīng)使用 DL-型，不使用 D-型。如使用 L-型，用量減半。
5.溶血標(biāo)本不宜使用，因血細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶活力較高，會(huì)影響測定結(jié)果。