mTn誘變基因產物的表位標記

材料與儀器

mTn誘變酵母菌株
pGAL-cre 含有2% (W V)棉籽糖的-Leu -Ura Raff CM缺失成分培養基平板和培養基 含有2% {m V)半乳糖的-Leu Gal CM缺失成分培養基 含有2% (m V)葡萄糖的-Leu Glc CM缺失成分培養基 5-FOA培養基平板（5-FOA) 丙三醇 無菌 30×
帶混合的孵育器

步驟

1)用pGAL-cre(pB277)標準操作轉化mTn誘變酵母菌株。在CM- Leu, -Ura缺失成分培養基平板上選擇轉化株。

此質粒包含以下元件：amp、ori、CEN和LEU2。

2)將轉化株接種到2 mL的含有2% (m/V)棉籽糖的-Leu，-Ura的Raff/CM缺失成 分培養基里，棉籽糖作為碳源抑制GAL啟動子。30℃通風孵育直到培養物生長到飽和狀態。

3)在2 mL含有2%的半乳糖的Gal/CM-Leu缺失培養基中100倍稀釋培養物，以半乳糖作為碳源。在2 mL含有2%的葡萄糖的Glc/CM-Leu失控培養基中100倍稀釋一份同樣的培養物，以葡萄糖為碳源，作為對照。30℃通氣培養2天。

一些菌株在半乳糖中生長得很不好，但是半乳糖誘導有時很有效，盡管沒有可見的生長跡象。

4)用以下方法檢驗菌株URA3標志物的丟失。

a.如果在2%的半乳糖的培養液中可見生長，用無菌水100倍稀釋培養液，取10μL稀釋液。

b.如果在2%的半乳糖的培養液中沒有發現生長，從未經稀釋的培養液中取10μL。

c.用無菌水100倍稀釋2%的葡萄糖培養液，取10μL稀釋液。

將取出的培養液滴在5-FOA培養基平板上；通過劃散小滴隔離單克隆。30℃孵 育5-FOA培養基平板直到在接種了在半乳糖中生長的菌株的培養基平板上看到 菌株生長。

根據作者的經驗，90%以上的被分析的細胞因半乳糖誘導造成由Cre重組酶介導的mTn編碼的URA3標記切除。轉座子編碼的URA3基因丟失表現為克?。ㄔ诎肴樘桥囵B基培養的菌株） 在5-FOA培養基平板上生長。因為葡萄糖抑制Cre重組酶表達，所以在葡萄糖培養基培養的 菌株在5-FOA培養基平板上應該不生長或很少生長。另一種方法也可印證：將第4步得到的 稀釋培養液放入CM培養基中并影印在CM-Um缺失成分培養基上，30℃孵育兩天。在半乳糖生長的培養液產生的Ura-細胞應比在葡萄糖中的多100倍。

5)從丟失了URA3 (半乳糖誘導后的獨特標志)的菌株中收集單克隆，于-70℃存放在15% (m/V)的丙三醇中。