茚三酮測定法

原理

茚三酮反應(yīng)是一種靈敏度高的蛋白實(shí)驗(yàn)。游離的氨基酸可以被高敏感性檢測出來。這個(gè)方法可以被用來繼續(xù)蛋白質(zhì)的酶降解。上述的酪蛋白降解在這個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中用作蛋白酶反應(yīng)。未水解的蛋白質(zhì)被三氯乙酸沉淀下來，而茚三酮反應(yīng)發(fā)生在上清液。

材料與儀器

蛋白酶溶液
Tris-HCl NaOH 乙酸 三氯乙酸 酪蛋白底物 乙酸緩沖液 KCN 乙醇 標(biāo)準(zhǔn) BSA 溶液 亮氨酸
水浴鍋 分光光度計(jì)

步驟

1. 酪蛋白降解

0.4 ml 酪蛋白底物恢復(fù)到 35℃，0.2 ml 蛋白酶溶液溶于 0.01 mol/L Tris-HCl pH 8.0，加入 10 mmol/L CaCl2。35℃ 培養(yǎng)混合物，10 min 后加入 1 ml 1.2mol/L TCA 停止反應(yīng)。用同樣的方法處理空白對(duì)照，不同點(diǎn)是加入 TCA 后，向酪蛋白底物中加入蛋白酶溶液。離心樣品 5 min。

2. 萌三酮反應(yīng)

0.2 ml TCA 上清液

0.1 ml 0.2 mmol/L KCN 溶于乙酸緩沖液

0.1 ml 茚三酮試劑

在水浴中放置 10 min 或者加熱箱中加熱到 100℃，而后在冰中冷卻 1 min，再加入 0.5 ml 50％ 乙醇。用水取代水解產(chǎn)物后，相對(duì)于空白對(duì)照檢測在 570 nm 處的吸收值。

3. 校準(zhǔn)曲線

為了定量，用 12 份（1～50 ul，補(bǔ)充至 200 ul）10 mmol/L 亮氨酸溶液繪制校對(duì)曲線。

常見問題

試劑：

0.01 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，包含 10 mmol/L CaCl2（1.47 g CaCl2·2 H2O 溶于 1 L）

0.2 mol/L NaOH（Mr＝40.0；0.8 g 溶于 100 ml H2O）

0.2 mol/L 乙酸（Mr＝60.05；12 g 溶于 1 L）

1.2 mol/L 三氯乙酸（TCA，Mr＝163.4；19.6 g 溶于 100 ml H2O）

酪蛋白底物：2 g 酪蛋白溶于 90 ml 0.01 mol/L Tris-HCl pH 8.0、10 mmol/L CaCl2 和0.2 mol/L NaOH，而后用 0.2 mol/L 的乙酸調(diào) pH 至 8.0，并用 H2O 將溶液補(bǔ)充至 100 ml。溶液被分為等分試樣并儲(chǔ)存于 -20℃。

2 mol/L 乙酸緩沖液，pH 5.4［溶解 270 g 三水乙酸鈉（C2H3O2Na·3H2O，Mr＝136.1）于 200 ml H2O，加 50 ml 冰醋酸并補(bǔ)充至 1 L］

10 mmol/L KCN（Mr＝65.1；65 mg 溶于 100 ml H2O）；

0.2 mmol/L KCN 溶于乙酸緩沖液（0.2 ml 10 mmol/L KCN＋9.8 ml 乙酸緩沖液，新鮮制備）茚三酮試劑（2，2-二羥基-1，3-茚滿二酮，Mr＝178.1，可購買到）

50％ 乙醇

標(biāo)準(zhǔn) BSA 溶液，40 ug/ml，將儲(chǔ)存液稀釋 100 倍，100 mg 溶于 25 ml 水中制備而得。

10 mmol/L 亮氨酸（DL-亮氨酸，Mr＝131.2；131 mg 溶于 100 ml 水中）

蛋白酶溶液