培養細胞膜片鉗記錄實驗
原理
培養細胞膜片鉗記錄是在無菌條件下將組織塊經過機械分離和消化酶的處理后分離成單個細胞并在孵箱中培養數天后進行常規膜片鉗記錄的一種方法。細胞原代培養過程與急性分離細胞的過程基本一致，但前者需在無菌條件下進行
材料與儀器
細胞
細胞培養液一般用F-12medium 細胞分離過程用液一般用Puck's溶液 消化酶胰蛋白酶或木瓜蛋白酶(10ng ml) 膠原酶(1mg ml) 膜片鉗
膜片鉗放大器 微操縱器 防振臺 顯微鏡 離心機 細胞培養箱等。其他輔材包括35mm細胞培養皿 離心管 游絲鑷等
步驟
1.將塑料蓋玻片剪成邊長為5-8mm的小玻片，均勻鋪在35mm的塑料培養皿中。
2.用75%酒精處理鋪好玻片的培養皿30min,然后再用滅菌過的雙蒸水洗1-2次，晾干后備用。
3培養細胞前Id分別用PDL(poly-D-lysine)和Laminin處理有小玻片的培養皿各1次，中間用雙蒸水洗l次。
4.將所有取材所用器械在75%酒精中消毒至少30min,準備冰盒，取出消化酶放至室溫，預冷Puck's溶液，將F-12media孵育在37'C水浴鍋中備用。
5.將動物處死，然后在冰臺上取材。所取組織迅速沖洗干凈以減少紅細胞的污染，然后置于冷的Puck's溶液中。
6.用事先消毒的精細剪刀去除不需要的部分，將組織塊剪碎，轉移至15ml離心管中。
7.加入lOng/ml木瓜蛋白酶或胰蛋白酶在37℃下消化10-15min。
8.低速離心1min,棄上清。
9加入膠原酶(1mg/ml)和dispase]](2.5mg/ml),37℃下消化10-15min。
1O.低速離心1min,棄上清。
11加入5ml預熱的F-12medium,混勻后再離心1min,棄上清。
12加入含有NGF(30ng/ml)的F-l2media,用事先燒好的玻璃吸管輕輕吹打3-5次，使細胞均勻分離，必要時可用不同口徑的吸管分2次吹打。
13.將分離的細胞轉移至35mm事先鋪有小玻片的培養皿中，然后放進孵箱中培養以備膜片鉗記錄。一般培養時間不超過1周均可用于膜片鉗實驗，但需隔天置換培養液，以保證細胞能獲得很好的營養和狀態。
14將有細胞貼壁的小玻片小心放進膜片鉗記錄的小槽內，接通灌流液即可進行常規膜片鉗實驗。由于培養細胞的不同，以及消化酶類型和用最的不同，培養細胞的狀態也不相同，用于膜片鉗記錄的細胞狀態要求較高一些。培養較好的細胞密度適中，細胞碎片和雜質較少（圖3-3)。在進行膜片鉗實驗時，我們一般要注意選擇健康的細胞，健康細胞的形態比較規則，表面干凈光滑，貼壁較好，在顯微鏡下有立體感。
注意事項
l特別需要強調的是所有的細胞操作都必須在超凈工作臺上進行，而且所有的手術器械，液體均需經過消毒或滅菌處理，嚴格保證細胞不被污染。
2根據實驗要求確定培養細胞動物的年齡、性別、體重，但通常動物的年齡越小，細胞耐受力越強，活性越好。另外，為保證神經元的活性，取材時間應盡可能短。
3.根據動物的年齡調整消化酶的種類和整。胎鼠的神經組織中纖維較少，僅用胰蛋白酶消化即可；隨著幼鼠的成長，神經組織中神經纖維逐漸增多，需要輔以膠原酶消化。另外還有DNA酶、木瓜蛋白酶等可以幫助消化。膠原酶及DNA酶、木瓜蛋白酶消化能力較弱，而胰蛋白酶消化能力較強，所以胰蛋白酶的量可以少些。具體實驗應參考相關文獻，根據神經組織的不同，調整消化酶的類型和用量。
4機械分離細胞的過程中，對組織塊的吹打一定要輕，因為此時已經有部分細胞被消化分離，因此，為了避免這部分細胞不受損傷，最好選用不同口徑的吸管分次吹打，以保證能收集到更多健康可用的細胞。
5膜片鉗實驗過程中，尤其是對千初學者，常會遇到的主要問題是封接困難，即不能形成巨阻封接，這時可檢查浴液的清潔程度，如有渾濁、灰塵、雜質等，就需更換液體或保持浴液的流動。玻璃微電極應在拉制后2-3h內使用，并防塵，電極內液必須經過濾后充灌。檢查電極夾持器、電極、負壓吸引管組成的系統的密閉性，如果負壓吸引管無漏氣，說明密閉性良好，很可能是電極夾持器中的橡皮墊不完整，應更換，注意橡皮墊的孔徑與電極外徑要匹配。如細胞表面不光滑，也可造成封接困難，需提高單細胞標本制備中酶消化的程度。其次遇到的問題是破膜時，細胞容易與電極分開，這表明細胞膜的韌性和彈性差，細胞狀態可能不好，需改進標本制作方法，保證細胞的活性。也可將電極拋光后使用。再一個問題是電極入液后，封接測試的電流基線不穩定，抖動劇烈，應檢查并調節浴液的灌流系統，排除液面的震動。檢查夾持器的穩定性，保證電極夾住后不活動。檢查浴槽地線的銀絲部分及夾持器中的銀絲色澤是否發白，及時氯化，保證浴槽地線導電良好。
常見問題
1對培養細胞來說，細胞的狀態至關重要，所以對于消化過程中酶的選擇及用量以及消化時間的控制非常重要。如消化不夠，則細胞表面粗糙或有附著物覆蓋，巨阻封接困難。若消化過度，則細胞表面干凈光滑，封接容易，但細胞膜的彈性差，封接后破膜及記錄過程中細胞容易和電極分離，細胞存活時間也短。因此，一定要針對不同的標本調整消化條件，在多次實驗后確立合適的消化酶量及消化時間。其次，可在消化過程中，每隔5min輕輕搖晃離心管，使得組織塊和酶能充分混勻，達到比較好的消化效果。最后，在記錄的前1d最好給細胞換液，以確保細胞記錄前有足夠的營養，以保持最好的狀態。
