神經(jīng)組織塊膜片鉗全細(xì)胞記錄實(shí)驗(yàn)
原理
通過全細(xì)胞膜片技術(shù)來檢測(cè)神經(jīng)元興奮性及其放電活動(dòng)，是電生理實(shí)驗(yàn)的基本方法。神經(jīng)組織塊膜片鉗技術(shù)相對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞膜片鉗技術(shù)而言，細(xì)胞更接近原始的生理環(huán)境，細(xì)胞具有更好的生理狀態(tài)，封接后可維持更長(zhǎng)的時(shí)間。
材料與儀器
細(xì)胞
人工腦脊液(ACSF) 消化酶濃縮液 ACSF通混合氣 尼龍網(wǎng)準(zhǔn)備 電極內(nèi)液
放大器（如Multiclamp700B) 數(shù)模轉(zhuǎn)換器（如Digidata1322series) 顯微鏡（如OlympusBXSI) 微操縱器
步驟
1.大鼠以0.5ml/100g1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，背部去毛備皮，頸椎脫臼法處死。
2.迅速剪開其背部皮膚，自L5、L3處橫斷脊椎，剪開肌肉，迅速取下L5-3脊椎，并置于冰水混合狀態(tài)的氧飽和ACSF中，以上過程要求迅速，在1min之內(nèi)完成，以保證神經(jīng)元活性。3.仔細(xì)去除脊椎周圍肌肉組織。
4將脊椎沿矢狀面縱向剖開，將其一分為二，用游絲攝剝離脊髓，如果采用單側(cè)疼痛模型，如CCD、CCI、SNL等，需分清左右側(cè)背根神經(jīng)節(jié)(DRG),其區(qū)分辦法為脊髓沿正中矢狀面剖開后其椎管直徑頭端大千尾端。
5沿脊椎連接處輕輕拼開，便可見到在椎板下面的背根神經(jīng)節(jié)，仔細(xì)分離周圍硬脊膜，用游絲攝輕輕夾住背根神經(jīng)節(jié)軸突束深部，將其輕輕提起，摘取L5、L3背根神經(jīng)節(jié)，置于氧飽和的室溫ACSF的35mm培養(yǎng)皿中（注意本步驟要求實(shí)驗(yàn)者動(dòng)作輕柔，切忌用游絲攝直接夾取神經(jīng)節(jié)，對(duì)其造成損傷）。
6在體視顯微鏡下，仔細(xì)剝除DRG周圍結(jié)締組織及被膜。
7.將組織塊及消化酶濃縮液（見前述）放入離心管中，用氧飽和的ACSF稀釋至2ml,于37℃恒溫水浴中孵育45min。
8取出組織塊，放入氧飽和室溫ACSF中，靜置1-2h后開始實(shí)驗(yàn)。
9.消化后細(xì)胞在40X物鏡下如圖3-4。
10.以上步驟可用于其他組織的制備，關(guān)鍵點(diǎn)在于保證目的細(xì)胞的活性及盡量清除附著于細(xì)胞表面的黏連蛋白、細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，消化液的配制及消化時(shí)間可根據(jù)不同的標(biāo)本進(jìn)行調(diào)整。
11．選用1.4mm的硬質(zhì)玻璃微管（國(guó)產(chǎn)毛還玻璃微管需用乙醇浸泡，超純水清洗并且超聲微波震蕩，以去除油脂和灰塵，烘干備用）。
12用乙醇燈將玻璃微管兩端輕微燒制，使其棱角變得圓鈍。
13.在P-97拉制儀上用三步法拉制出尖端直徑為1μm左右的玻璃微電極（檢驗(yàn)方法為灌入電極內(nèi)液后入水電阻為5-8MΩ)。
14.電極在實(shí)驗(yàn)前拉制，不可過夜。
15充灌電極內(nèi)液，內(nèi)含玻璃毛細(xì)管的電極可用帶有合適直徑針管的注射器從尾部充灌。
16酶消化后的DRG置于循環(huán)灌流的氧飽和ACSF記錄槽中，用有尼龍網(wǎng)網(wǎng)格的"U"形鉛金絲固定，使標(biāo)本完全浸于ACSF中，并保證一定的灌流速度使神經(jīng)元能夠充分補(bǔ)給，并將液流調(diào)整平穩(wěn)后，開始封接等操作。
17實(shí)驗(yàn)用Olympus正置顯微鏡，用40X浸水物鏡觀察單個(gè)DRG神經(jīng)元形態(tài)并進(jìn)行可視封接。在高倍鏡下找到細(xì)胞(Camera處拉桿處于拉出狀態(tài)，鏡頭拉桿處千推入狀態(tài)），逐漸涸亮視野，則可見清晰的細(xì)胞圖像。紅外可視條件下，選擇表面光滑、輪廓清楚、外觀柔和、有彈性的細(xì)胞進(jìn)行封接，電極尖端接觸細(xì)胞表面容易形成凹陷。而狀態(tài)較差的神經(jīng)元?jiǎng)t表面皺縮或腫脹、輪廓模糊不清、可見到細(xì)胞核。
18.將充灌好細(xì)胞內(nèi)液的玻璃微電極安裝于電極夾持器上，并用螺帽固定（注意用于固定玻璃微電極的橡皮環(huán)必須與之緊密結(jié)合，不能產(chǎn)生漏氣，否則將影響封接）。
19.通過與電極夾持器相連的硅膠管給予電極尖端適當(dāng)正壓充灌，防止玻璃微電極尖端污染。
20.通過微操作系統(tǒng)將玻璃微電極尖端下降至灌流液面以下。此時(shí)采用pClamp軟件的sealtest可測(cè)量玻璃微電極電阻，保證其在5-8Ω。
21電極剛?cè)胨畷r(shí)測(cè)試波形基線不在零位置上，必須將基線補(bǔ)償回零。在Multiclamp700B界面上采用Auto按鈕，如為Muiticlamp200B則需用手動(dòng)調(diào)節(jié)。
22低倍物鏡下找到電極并將其置于視野中心或略偏左側(cè)。
23.將高倍鏡入水，使之處于最低狀態(tài)，逐漸將高倍鏡上抬找到電極尖端，中倍Manipulation速度下降至可見細(xì)胞輪廓，將Manipulation轉(zhuǎn)為慢速，將電極尖端位置與細(xì)胞相對(duì)位置調(diào)整好，慢速接觸，當(dāng)電極尖端與細(xì)胞膜接觸時(shí)，sealtest指示Rm會(huì)有所上升，將電極進(jìn)一步下壓，Rm會(huì)進(jìn)一步上升。
24通過與電極夾持器相連的塑膠管向電極內(nèi)稍加負(fù)壓，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，Rm值會(huì)迅速上升，直至形成高阻封接(GΩ封接）。
25電極電容補(bǔ)償，使用Multiclamp700B放大器時(shí)，直接依次點(diǎn)擊快慢電容補(bǔ)償?shù)腁uto按鈕即可（圖3-5)。
26采用更大的負(fù)壓吸引，打破細(xì)胞膜，使電極內(nèi)與細(xì)胞內(nèi)貫通，成為全細(xì)胞膜片鉗記錄模式。此步驟容易造成封接的不穩(wěn)定，需格外小心。對(duì)于初學(xué)者來說需要一個(gè)摸索過程，可采用嘴吸的方法，一般采用脈沖式負(fù)壓吸引，效果較好。一些放大器提供了"Zap"點(diǎn)擊破膜功能。
27串聯(lián)電阻補(bǔ)償。勾選"Wholecell",勾選"RsCompensation",將"RsCompensation"下的"correction"及"Prediction"上升至70%以上，同時(shí)逐漸調(diào)整''Wholecell"下的電容及電阻值，使之達(dá)到要求，見結(jié)果判讀部分（圖3-6)。
28.通過Clampex軟件設(shè)置的參數(shù)對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行電生理實(shí)驗(yàn)。破膜形成全細(xì)胞記錄模式后，可在Multiclamp700B軟件界面上讀出I1,.k值，又值，在Clampex軟件中使用Membranetest可測(cè)最Cm、Rm、Ra值，確保18,.k<200pA,Vm<-50mV,Ra<20mfl,rm>SOMO。Rm最好為Ra的10倍以上，否則需要進(jìn)行串聯(lián)電阻補(bǔ)償。圖3-8為應(yīng)用Clampex記錄到的典型電流鉗記錄，圖3-9為應(yīng)用Clampex記錄得到的典型電壓鉗記錄。
注意事項(xiàng)
1.取材過程中要保證神經(jīng)元隨時(shí)處于氧飽和ACSF中或者處千有血流灌注的狀態(tài)下。
2.細(xì)胞內(nèi)液及細(xì)胞外液的pH值和滲透壓值要符合生理狀態(tài)。
3.對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鉗制時(shí)，要選擇表面光滑的方位。
常見問題
1制備電極內(nèi)液時(shí)要保證整個(gè)過程溫度在O℃左右，并且內(nèi)液要用濾膜過濾3次以上，以保證內(nèi)液中無雜質(zhì)。
2.實(shí)驗(yàn)過程中撕膜的程度決定了實(shí)驗(yàn)的成敗，撕除背根神經(jīng)節(jié)外膜后（硬脊膜），應(yīng)注意其還有一層膜（蛛網(wǎng)膜及軟脊膜），應(yīng)盡量將其去除，取出后神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元有略蓬松感。撕膜時(shí)動(dòng)作輕柔．注意勿損傷神經(jīng)元。
