帕金森病模型的制作實驗

原理

帕金森病(Parkinson disease, PD)是中老年常見的基底節神經元進行性退行性疾病，主要累及黑質和紋狀體多巴胺遞質系統。6-脛基多巴胺(6-0HDA)和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)是兩種主要的多巴胺能神經毒性物質，可以很好的模擬PD患者的臨床表現和病理改變。由于6-OHDA不能通過血腦屏障，需立體定向注入腦內，目前多采用黑質致密部(SNc)、紋狀體(cs)、中腦腹側被蓋區(VTA)、前腦內側束(MFB)等部位進行注射；MPTP有高度的親脂性，易通過血腦屏障，選擇性濃集于黑質，通常經腹腔或皮下注射。

材料與儀器

雄性SD大鼠 體重200-250g 雄性C57 BL小鼠 體重20-25g
6-OHDA和MPTP(Sigma公司）
立體定位儀(NarishigeJAPAN) 顱骨鉆 吸引器 1μL或5μL微扯注射器

步驟

1.6-OHDA致大鼠PD模型的制作：

(1)SD大鼠稱重，按每籠5-6只飼養。在實驗設計的時間點，將大鼠以1%戊巴比妥鈉麻醉，待動物失去知覺即可開始操作。

(2)大鼠用立體定位儀將雙耳及門齒固定。自矢狀縫皮膚劃開，棉球止血，定位，鉆孔，挑破腦膜（以黑質致密部單側損毀為例，參照Paxinos圖譜確定注射坐標，前顱后5.2mm,左側或右側旁開2.2mm,進針深7.8mm)。

(3)微量注射器注射，以濃度2μg/μL，注射速度1μL/min注射，并留針10min,以1mm/min的速度退針。止血，縫合傷口。在實驗動物蘇醒的過程中，注意保溫，觀察各項生命體征。156第四章，神經系統疾病常用動物模型的制作在手術后的數周內，觀察動物的進食、體重、行為學變化等情況。單側損毀的方法，技術上比較成熟，操作較易、死亡率低，模型相對穩定，易區分雙側肢體運動細小異常，能對比患側黑質的手術前后及與正常側表現。雙側毀損是較大范圍神經化學和行為學損傷，更似人類PD。但對基底節下丘腦等特殊區域損傷較大，死亡率很高，且操作較繁瑣，目前PD實驗研究中較少應用。:

2.MPTP致小鼠PD模型的制作：

C57/BL小鼠稱重，每籠5-6只左右。戴手套將小隊的頭頸部、尾部固定，經腹腔或皮下注射，單次注射的劑瞿為20-30mg/kg。根據實驗要求和目的，可分為快速模型和慢速模型。快速模型可分為單次注射和多次注射。單次注射的劑最為30mg/kg,該模型損傷輕，易恢復；多次注射的劑量為20mg/kg,每隔2h注射1次，共3-4次，該模型損傷快且嚴重，DA神經元的損傷到死亡可以在3d內完成。慢速模型需多次注射，每天1次，單次注射的劑量為20mg/kg,連續注射5-7d。該模型的成活率較高，實驗周期較長。

3結果判定：PD模型可通過體重檢測、旋轉桿實驗、曠場實驗、懸掛測試等進行評價。黑質多巴胺神經元的損傷程度可通過阿撲嗎啡（或苯丙胺）引發的向健側（或傷側）旋轉運動來較好地評估。與對照組相比，成功的模型組會出現明顯的體重增加緩慢、自主活動減少等特點。另外，通過免疫組化或分子生物學的方法觀察黑質、紋狀體等部位的TH表達的明顯減少也是判定PD模型成功與否的一個金標準。

注意事項

1.MPTP有劇毒，在稱量溶解和注射時一定做好個人的防護工作；MPTP、6-OHDA等試劑現用現配。

2實驗分組及動物較多，一定要做好標記，以免混淆，造成實驗失敗。

3.SD大鼠在造模后，一定注意保溫、吸痰。根據大鼠的夜間習性，下午或晚上造模的成活率更高些。

4.小鼠應激反應較強，抓取時應帶厚的手套，以免被咬到。

5.小鼠在注射MPTP后30min內會出現顫抖、口角抽揣、肢體平衡能力差等一系列行為學的改變，可能是MPTP對腎臟、肝臟等器官產生的毒害作用引起的一些生理指標，如血壓、體溫和肝功能等的變化。因此，應在MPTP最后一次注射后第3天或第4天以后再進行行為學測試，更能客觀地檢測小鼠PD模型的行為學變化。

6.6-OHDA致PD模型定位注射時注射速度宜緩慢，過快可導致注射范圍擴散；微量注射器選擇時避免注射針頭過粗造成損毀區域增大。

7.進行行為學實驗時，盡星避免外界環境（嘈雜、強光等）的干擾。

常見問題

造模的成功與否，決定了進行各相關指標檢測結果質址的好壞。制備PD模型選取時需綜合考慮造模目的和用途、靶點的位置(SN,CS、vTA、MFB)、藥物劑量多少和浸潤范圍大小、損傷的程度（部分、完全）、動物的安全性（死亡率）和有效性（成功率）、操作難易性、精確性和穩定性等等。因此，在兩模型具體應用時要有所選擇：

① 根據藥物特性選擇建模方法6-OHDA需立體定向注入靶位、MPTP經腹腔或皮下注射；

② 根據藥物敏感性選擇動物大鼠對6-OHDA敏感，制備模型時按前述因素綜合考慮，靈長類對MPTP最敏感但受限制，而常用小鼠；

③ 根據應用目的和用途選擇模型6-OHDA注射靶位選取靈活，注射劑量可調，動物行為變化穩定可靠，檢測量化性好，多用于PD的臨床前藥物研究和藥理療效判定、神經保護、細胞移植和基因治療等方面的研究，MPTP用藥方案多樣，誘導產生的癥狀及病理、生化改變方面與人類PD更相似，主要用于PD病因、發病機制，藥物毒理試驗等研究。