實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)模型

原理

1973年Patrick等首先從電鰻電器官提取純化乙酰膽堿受體(AChR),免疫接種新西蘭大白兔后獲得實驗性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG)模型，可以模擬重癥肌無力。后來在大鼠、小鼠、豚鼠、猴中用同樣方法也制備了EAMG模型。隨著蛋白質組織化學的發展，現已掌握了人及一些實驗動物AChR主要致病區的肽鏈結構，因此出現了用合成多肽作為免疫原制備EAMG模型的方法。

材料與儀器

實驗動物6-8周雌性Wister大鼠 體重200-250g
免疫原加利福尼亞電鰻AChR-a的146-162序列片段

步驟

(1)免疫原的制備人工合成加利福尼亞電幔AchR-a的146-162序列片段作為免疫原，其氨基酸序列為Ala-Ile-Phe-Lys-Ser-Tyr-Cys-Glu-Ile-Ile-Val-Thr-His-Phe-Pro-Phe-Asp。

(2)模型制備程序為：①將合成多肽20μg溶解于100μL的PBS緩沖液中(pH7.2),并加入等量的CFA,充分混合，直到水溶液完全被油滴吸附；②皮下注射接種于背部6處（每處20μL)、兩后肢墊（每處20μL)和尾基部(40μL); ③將合成多肽20μg溶解于50μL的PBS緩沖液中(pH7.2)，并加入等量的不完全弗氏佐劑，充分混合；④混合注射于背部3處（每處20μL)和尾基部(40μL)。;

結果判定：對于實驗性自身免疫性重癥肌無力動物模型來講，單純的癥狀如體重下降，活動、進食減少、閉目等并無特異性。血清抗體檢查存在抗體陰性和檢出率的問題。動物電生理的檢查，存在一些干擾因素，不能排除誤差。因此必須綜合多個指標進行分析，其中癥狀、AchR-Ab抗體滴度和電鏡結果最有意義。

(1)臨床癥狀按照Lennon分級法將癥狀嚴重程度分為：

①0級沒有肯定的無力表現；②1級撕咬無力，四肢力量較差，在光滑地面上前肢打滑，活動減少且易疲勞；③2級明顯無力，休息時身體呈隆起姿勢，頭尾下垂，大腿外展，前肢（趾）彎曲，動作笨拙，步態不穩；④3級嚴重無力表現，無撕咬動作，肌肉震顫，呼吸困難，瀕死或死亡。癥狀居于中間者，分別評為0.5、1.5和2.5級。每天按照以上標準觀察并記錄癥狀變化。

(2)電生理檢查用水合氯醛溶液將小鼠麻醉后固定在木板上，將成對刺激電極以2-3mm距離插至坐骨切跡附近肌肉內，記錄電極置于胖腸肌內側頭（跟腿附著處），重復用50-100Hz電刺激，并記錄小鼠排腸肌電位及收縮波幅。成功模型可見重復神經電刺激呈衰減反應。

(3)電鏡檢查通常將小鼠斷頸法處死，在解剖顯微鏡下沿坐骨神經分離組織，于腓腸肌終末分支處迅速取其排腸肌組織進行透射電鏡觀察。成功模型大鼠神經肌肉接頭褶局部紊亂、溶解、消失，突觸前膜囊泡減少，線粒體等細胞器空泡化。

(4)AChR-Ab滴度檢測免疫后7周經頸動脈采血分離血清，采用ELISA測定AChR-Ab含量。按公式：P/N=待測血清D（λ）490nm/正常組D(h)490nm計算。以P/N值≥2.l為陽性，≤1.4為陰性，介于兩者之間為可疑陽性

注意事項

(1)動物選擇大鼠、小訊、豚鼠、家兔及猴均可誘導產生EAMG,但是不同種屬動物易感性不同。目前最常用到的實驗動物為大鼠和小鼠，且大鼠EAMG模型和人類更為接近。大鼠近交品系對該模型的易感性依次為Wistar > munich > fischer > Lewis > Buffalo > Brown > Norway > ACI > Wistar Kyoto > Kopen-hagen > Wistar Furth,因此最常使用Wister大鼠作為實驗對象。隨著轉基因小鼠的普遍使用，小鼠EAMG模型也逐漸受到重視，目前發現，C57BV6、SJL和AKP易感性較高，而SWR、BALB/c和C3H/He易感性較低。

(2)抗原的種類、選擇和制備傳統方法采用加利福尼亞電鰻電器官分離乙酰膽堿受體(AchR)免疫大鼠建立EAMG模型。隨著基因克隆技術的發展和人類對乙酰膽堿受體亞基及其氨基酸序列的深入研究，可以通過人工合成加利福尼亞電綬的AchR-o146-162序列片段作為免疫原，其氨基酸序列為：Ala-Ile-Phe-Lys-Ser-Tyr-Cys-Glu-Ile-Ile-Val-Thr-His-Phe-Pro-Phe-Asp。此外，Angela等用人類AChR-a的138-167、157-188、185-199、309-345和338-368片段作為免疫原對兔進行動物模型的制備，結果證明AChR-0138-167片段的成功率最高。