動物總RNA的提取及含量測定

一、實驗目的
（1）了解制備RNA幾種方法的原理及優缺點

（2）掌握稀堿法提取兔肝RNA的原理和操作技術

二、實驗原理
細胞內大部份RNA均與蛋白質結合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。因此，分離制備RNA時，首先遇到的是必須使RNA與蛋白解離，并除去蛋白質。由于RNA的種類來源和存在形式不同，所用的制備方法各異，一般常用的方法有，鹽酸法，稀堿法和苯酚法。其中，以苯酚法使用較為廣泛。產品純度高，適合小規模生產。動物組織中以肝臟器官RNA含量較為豐富。本實驗就是將兔肝組織勻漿，在酚與十二烷基硫酸鈉的存在下，RNA與蛋白質分離使蛋白質變性凝固。RNA溶解在水相中，用乙醇使RNA從水相中沉淀，達到分離。RNA與濃鹽酸共熱時，即發生降解，形成的核糖繼而轉變成糠醛，后者與3， 5-二羥甲苯反應呈鮮綠色，該反應需用三氯化鐵和氯化銅作催化劑，反應產物在670nm處有最大吸收。RNA在20－250微克范圍內，光吸收與RNA濃度 成正比。地衣酚反應特異性較差，凡是戊糖均有此反應。RNA和其他雜質也能給出類似的顏色。

三、試劑與器材
冰箱、恒溫水浴、離心機、真空干燥器、煤氣燈、冰鹽浴等。

0.05mol/L醋酸緩沖液（PH5.0）、25%SDS、80％酚、2mol/L醋酸鈉、95％乙醇RNA標準溶液、樣品待測液、地衣酚試劑

四、操作方法

1、RNA 提取：將新鮮兔肝浸入預冷0度0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(PH5.0)中,除去肝臟處的結締組織,除去血凝,用濾紙吸干,稱取0.9克.(已稱好)

2、取0.9克肝臟,加入 0.05mol/L醋酸緩沖液(PH5.0)9毫升,250克/升.SDS1.5毫升,移入勻漿管中,勻漿后再加入等體積80%酚,再勻漿一次.

3、移入三角瓶中,置65度水浴中繼續振搖5-8分,取出流水冷卻.

4、離心,3000轉/分,10-15分,上層為稍混濁,含有RNA的水相,中層為變性蛋白,下層為酚液,管底殘渣,含有RNA.吸出上層水溶液要RNA的收獲量,可向中下層液中再加1/2體積的醋酸緩沖液,同樣在65度水浴中振搖提取一次,離心后所收得的上層水液,可與上述水液合并,本次實驗只提取一次.

5、用量筒測水液的量,加入1/10體積的2mol/L醋酸鈉混勻.再加入2.5倍體積預冷的95%乙醇混勻,冷卻放置絮狀沉淀充分形成.

6、離心3000轉/分,10分鐘,傾出上清.

7、沉淀用蒸餾水4毫升溶解,慢慢向沉淀中加入蒸餾水,不斷攪拌,至沉淀完全溶解即可,待作含量測定.

五、關鍵步驟與注意事項

① 一定要嚴格控制溫度對RNA的影響 

② 防止核酸酶的降解作用