CIK細胞的制備方法
【背景】
CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的縮寫，中文全稱為“細胞因子誘導的殺傷細胞”。 CIK是單個核細胞在CD3單抗和多種細胞因子(包括IFN-g, IL-2等)的作用下培養獲得的一群以CD3+CD56+細胞為主要效應細胞的異質細胞群， 其既具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，又具有NK細胞(自然殺傷細胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。CIK細胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對正常組織毒性低，體外可高度擴增等特點，是目前臨床上廣泛使用的過繼性免疫治療細胞。
【培養原理】
CIK培養用細胞因子和抗體：
n CD3激發型單抗：
T細胞活化的第一信號來自于T細胞表面的受體，即T細胞抗原受體(T cell antigen receptor, TCR)與APC提呈的抗原的特異性結合，也就是T細胞對抗原的特異性識別。TCR是由2條不同肽鏈構成的異二聚體，在T細胞表面，其與CD3分子通過非共價鍵結合，形成TCR/CD3復合體。TCR識別特異性抗原后會引起CD3和T細胞表面的輔助受體CD4或CD8分子的胞漿尾部聚集，進而激活與胞漿尾部相連的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞漿區的免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)進一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，從而引起激酶活化的級聯反應(磷脂酰肌醇途徑或MAP激酶途徑等)，最終通過激活轉錄因子，使其進入細胞核內，結合于調控T細胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表達和轉錄，T細胞因而由靜止狀態轉為增殖和活化狀態。
由上可見，CD3分子在T細胞活化信號的轉導中起著極其關鍵的作用。CD3激發型單抗與T細胞表面CD3分子特異性結合后，可引起CD3分子胞漿區ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，進而導致T細胞增殖和活化的下游信號的激活，從而使T細胞增殖和活化。也就是說，CD3激發型單抗能夠模擬抗原與TCR/CD3復合物的識別和激活過程，從而引起T細胞的增殖與活化，因此是CIK細胞培養中不可或缺的刺激因素。
此外，CD3激發型單抗在選用時一定要注意克隆號。研究表明，僅克隆號為OKT-3的CD3激發型單抗可以刺激所有人的T細胞的增殖，而其它克隆號的CD3激發型單抗僅能刺激一部分人的T細胞。因此，在進行CIK培養時，最好選用OKT-3克隆，以保證每個患者的T細胞均能被激活。
n IL-2 (白細胞介素-2)
IL-2最初發現時被稱為T細胞生長因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T細胞增殖最重要的細胞因子。IL-2既是自分泌細胞因子，也是旁分泌細胞因子，其通過與T細胞表面的IL-2受體(IL-2R)的特異性結合而促使T細胞活化，并進入細胞分裂狀態。此外，IL-2還可刺激NK細胞的生長并增強其殺傷能力。因此CIK細胞培養中須添加IL-2，以促進T細胞的增殖與活化。
n IFN-g (干擾素-g)
IFN-g 具有上調外周血淋巴細胞表面IL-2R表達的作用，因此會增強T細胞對IL-2促增殖反應的敏感度和強度。在誘導CIK細胞形成的過程中加入IFN- g ，可降低IL-2的用量。研究發現，IFN-g加入的順序與CIK的細胞毒活性密切相關。先加入IFN- g，培養24后再加入IL-2，可明顯提高CIK的細胞毒活性。
n IL-1a(白細胞介素-1a)
IL-1a也可以介導外周血淋巴細胞表面上調表達IL-2R。當IL-1a與IFN-g和激發型CD3單抗合用時，可以明顯提高CIK 的細胞毒作用。
【細胞制備】
1． 外周血單個核細胞的采集
1.1 用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞50-100mL；
1.2 淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞(PBMC)；
1.3 無血清培養液洗滌2次，獲得純度在90%以上的PBMC。
2． CIK細胞的培養及鑒定
2.1 將PBMC按1-2 x 106/ml的濃度懸浮于無血清培養液中，加入1,000 U/ml 的重組人IFN-g，37oC，5%CO2培養箱中培養；
2.2 24h 后加入50ng/ml 的CD3 單克隆抗體和300 U/ml 的重組人IL-2，刺激CIK 細胞的生長和增殖；
注：此時也可同時加入100 U/ml的重組人IL-1a。
2.3 每3天半量換液或擴瓶一次，并補加重組人IL-2 300 U/ml；
2.4 在培養的第14d，收獲CIK細胞。
2.5 CIK細胞質控：
2.9.1 臺盼藍染色檢測：活細胞應在80%以上；
2.9.2 流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表達：CD3+CD56+細胞的比例應在20%以上。
2.9.3 細胞殺傷實驗：以CIK細胞為效應細胞，以腫瘤細胞(可為原代腫瘤細胞或腫瘤細胞株)為靶細胞，將效應細胞與靶細胞按10 : 1(數目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶細胞1 x 104個，終體積為200 ml，設3個復孔。培養4h，然后取培養上清，用乳酸脫氫酶(LDH) 試劑盒檢測效應細胞對靶細胞的殺傷率。
2.9.4 收獲細胞前，取少量培養物進行細菌、真菌培養，并檢測支原體、衣原體，及內毒素(標準：病原學檢測陰性，內毒素<5 Eu)。
【推薦試劑】
注：Animal Free意為無動物成分。無動物成分的重組細胞因子在生產過程中不會有任何動物源性物質，尤其是牛蛋白的混入，使得最終獲得的重組人蛋白中不含任何動物成分。這樣可避免動物病原體(如瘋牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的機體異種排斥和過敏反應，因此細胞治療的體外細胞培養過程中最好使用無動物成分的重組細胞因子。
【參考文獻】
[1] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125-2133
