慢病毒包裝操作說明（僅供參考，不同實驗室需要調(diào)整）
（僅供參考，不同實驗室需要調(diào)整）
一、慢病毒包裝
1、基本介紹：慢病毒包裝系統(tǒng)由一個包裝質(zhì)?；旌衔锖吐《据d體質(zhì)粒組成，慢病毒質(zhì)粒pLVX-Puro包含HIV的基本元件5’ LTR和3’ LTR以及一些輔助元件；pSPAX2質(zhì)粒含編碼HIV病毒主要蛋白的gag基因和編碼病毒特異性酶的pol基因；pMD2.G質(zhì)粒含有提供病毒包裝需要的VSV-G基因。
2、實驗材料：指數(shù)生長的293T細胞；轉(zhuǎn)染試劑；質(zhì)粒Mix= pLVX: pSPAX2: pMD2.G=4:3:1（以上5種生物材料我們平臺均可提供）
3、包裝步驟：
①通過胰酶消化收集細胞，根據(jù)您實驗需要選擇接種于培養(yǎng)皿，置于含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱孵育8-24h，細胞貼壁后進行轉(zhuǎn)染。
②充分混勻核心質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑，靜置15-20min。
③將混合液逐滴加入細胞培養(yǎng)皿中，輕輕混勻后置于含5％CO2的37℃培養(yǎng)箱孵育。
④轉(zhuǎn)染后24h、48h左右收集含慢病毒的上清，分裝凍存于-80℃。（如果滴度比較低，可以用超速離心濃縮）
⑤將細胞平鋪于培養(yǎng)皿，12-24h后換液，最佳密度為30%－50％。加入收集的病毒上清液培養(yǎng)。細胞長滿后傳代或者檢測表達。
二、包裝檢測
1、含有熒光標記或報告基因的病毒載體，可通過轉(zhuǎn)染細胞測定其滴度。
2、不含報告基因的病毒載體，可通過試劑盒測定病毒顆粒中相關(guān)病毒蛋白的活性或含量確定其滴度。
3、通過定量PCR測定滴度。
三、注意事項
1、避免小提的質(zhì)粒，其濃度和純度一般比大提質(zhì)粒的濃度低，可能會降低包裝效率。
2、轉(zhuǎn)染時的細胞密度在40-60%之間比較合適，當細胞出現(xiàn)匯合時，及時更換或添加新鮮培養(yǎng)基以保持細胞健康狀態(tài)。
3、收集病毒上清時離心可以去除細胞碎片及少數(shù)懸浮的293T細胞，必要時可以過濾以徹底去除細胞成分的污染。
4、收集病毒時，過濾會去除細胞污染，VSV-G殘留片段對細胞的毒性，但也會部分影響病毒滴度。
5、避免多次反復(fù)凍融，凍融會降低病毒侵染效率；病毒放置于4℃也會降低侵染效率。
6、VSV-G會介導(dǎo)病毒與細胞的融合，對細胞造成一定毒性，所以在重懸病毒沉淀時，體積視具體實驗而定。
7、使用病毒侵染細胞時，細胞密度對侵染效率影響較大，細胞匯合密度過高會降低侵染效率。
