細(xì)胞裂解液配方和選擇
1? 細(xì)胞裂解液的目的
(1)利用去垢劑破壞脂質(zhì)雙分子層，破裂細(xì)胞;
(2)溶解蛋白;
(3)蛋白變性使其穩(wěn)定;
(4)抑制蛋白酶活性。
常見的細(xì)胞裂解液成分：
50mM Tris-HCl pH7.4 (緩沖體系)
150mM NaCl (等滲體系)
1mM PMSF (蛋白酶抑制劑)
1mM EDTA (變性劑和穩(wěn)定劑)
5μg/ml Aprotinin (蛋白酶抑制劑)
5μg/ml Leupeptin (蛋白酶抑制劑)
1% Triton X-100 (弱變性劑)
0.1% SDS (強(qiáng)變性劑和溶解劑)
1% Sodium deoxycholate (中度變性劑和溶解劑)
2? 細(xì)胞裂解液的一般成分
1. 裂解成分：破壞細(xì)胞膜裂解組織或細(xì)胞。
裂解強(qiáng)度：SDS(基本會(huì)使蛋白變性失活) > Triton X-100 > NP-40
英文名 | 中文名 | 裂解強(qiáng)度和去垢劑類型 | 作用 |
Sodium Deoxycholate | 脫氧膽酸鈉 | 中度；陰離子型 | 能夠有效破壞多種蛋白間的相互作用 |
1% Triton X-100 | 曲拉通X-100 | 溫和；非離子型 | 溶解脂質(zhì)，增加細(xì)胞膜的通透性 |
0.1% SDS | 十二烷基硫酸鈉 | 強(qiáng)；陰離子型 | 強(qiáng)變性，極易促溶，能夠有效破壞多種蛋白間的相互作用 |
1% NP-40 | 乙基苯基聚乙二醇 | 溫和；非離子型 | 可破壞掉細(xì)胞膜，獲得胞漿蛋白，對(duì)核膜的破壞作用較弱 |
2. 蛋白酶抑制劑：抑制蛋白酶的活性，避免蛋白過度降解。
英文名 | 中文名 | 作用 |
PMSF | 苯甲基磺酰氟 | 抑制絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶 |
Leupeptin | 亮肽素 | 抑制絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶 |
Aprotinin | 抑肽酶 | 抑制絲氨酸蛋白酶 |
Pepstatin | 胃酶抑制劑 | 抑制天冬氨酸蛋白酶、多種微生物酸性蛋白酶 |
EDTA-Na2 | 乙二胺四乙酸 | 多數(shù)核酸酶和有些蛋白酶需要金屬離子激活酶的活性，EDTA可螯合金屬離子，抑制酶活 |
3. 磷酸酶抑制劑：抑制去磷酸化作用。
英文名 | 中文名 | 作用 |
NaF | 氟化鈉 | 抑制去磷酸化作用 |
Na2VO4 | 釩酸鈉 | 抑制去磷酸化作用 |
Beta-glycerophosphate | β-甘油磷酸酯 | 抑制去磷酸化作用 |
Na2PO4 | 磷酸鈉 | 抑制去磷酸化作用 |
* 可根據(jù)目的蛋白的特性對(duì)裂解液配方做出調(diào)整，例如：非磷酸化蛋白可不添加磷酸酶抑制劑；IP背景高，選用裂解度高的裂解液；目的蛋白IP 不下來，選用裂解度低的裂解液等等。
1.細(xì)胞裂解液影響細(xì)胞膜和核膜的破壞效率， 所以應(yīng)根據(jù)目標(biāo)分子在細(xì)胞內(nèi)的定位選擇裂解液。此外，不同的細(xì)胞和組織具有不同的膜組成和結(jié)構(gòu)，需要針對(duì)其特性選擇特定裂解液。使用錯(cuò)誤的細(xì)胞裂解液可能導(dǎo)致細(xì)胞裂解不完全，進(jìn)而影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
2.適當(dāng)?shù)牧呀庖簩?duì)于維持細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)分子的穩(wěn)定性和完整性至關(guān)重要。例如，在核酸研究中，裂解液會(huì)影響RNA、DNA及其修飾的完整性。在蛋白質(zhì)組學(xué)中，它影響蛋白質(zhì)和翻譯后修飾的穩(wěn)定性。使用錯(cuò)誤的緩沖液可能導(dǎo)致這些分子的降解或變性，從而損害下游分析的準(zhǔn)確性。
3.細(xì)胞裂解液對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的一致性有重要的影響。不同的緩沖液pH值、離子強(qiáng)度和去垢劑不同，這些因素可能影響酶、蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞組分的結(jié)構(gòu)和活性。保持緩沖液一致性對(duì)于確保實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性至關(guān)重要。
4.選擇錯(cuò)誤的裂解液會(huì)造成樣品中無目的蛋白情況，例如目的蛋白為核蛋白時(shí)請(qǐng)勿使用NP40 這類溫和的裂解液。
如果是分泌型蛋白，例如細(xì)胞因子或趨化因子等，組織或者細(xì)胞的裂解液可能并不能直接反映目的蛋白的表達(dá)水平，一方面可以通過刺激處理促進(jìn)其胞內(nèi)表達(dá)，另一方面可以嘗試ELISA或者Luminex 多因子檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)細(xì)胞上清液或者生物體液等進(jìn)行檢測(cè)。此外，樣本收集及保存過程中，需要考慮目的蛋白降解的風(fēng)險(xiǎn)，建議使用新鮮的裂解液對(duì)新鮮收集的樣本進(jìn)行蛋白提取，并確保裂解液中蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑活性，防止蛋白降解。樣本盡量低溫保存，并避免反復(fù)凍融。
