醬香大曲中高溫放線菌的篩選及基因組解析
“曲乃酒之骨”，醬香型高溫大曲在發酵條件下富集了豐富的功能微生物，在生產過程中為整個醬酒釀造體系提供了微生物、酶系、風味及其前體物。高溫放線菌是一類革蘭氏陽性、化能異養的微生物類群，能夠在極端環境下生存和繁殖，能代謝產生酯化酶、淀粉酶、磷酸酶等多種酶和風味及其前體物。該菌在醬香型白酒釀造體系中屬于一類具有重要應用潛力的微生物資源，其在白酒釀造體系中的功能尚不清楚。本課題組在前期研究中也成功建立了一種從醬香大曲中分離、篩選高溫放線菌的方法，從醬香型大曲中分離鑒定了多株高溫放線菌，證實這些菌株具有良好的產吡嗪風味組分能力，并對其代謝產吡嗪的途徑及機理進行解析。
近日，基于課題組前期的工作，貴州大學釀酒與食品工程學院對醬香型高溫大曲中的高溫放線菌進行分離篩選，結合多相分類學技術進行菌株鑒定，并利用第二代Illumina和第三代PacBio結合的測序技術對所篩選菌株進行全基因組測序，從基因組層面解析其潛在的代謝功能特性，分析該菌株代謝典型風味組分的潛在機理，旨在為今后繼續深入解析高溫放線菌類群微生物產風味物質，特別是四甲基吡嗪的生物合成代謝途徑及機理提供參考。
1 菌株分離篩選及鑒定
1.1 菌株的形態學特征
從醬香高溫大曲中分離得到1 株純種菌株FBKL4.014，根據菌落形態特征初步判斷其可能歸屬于高溫放線菌。
菌株宏觀形態學觀察結果顯示，該菌株長勢良好，在培養基正反兩面表現出的生長趨勢不同，菌落總體呈缺刻圓狀、突起、有較多皺褶、質地干燥致密，基內菌絲呈淺黃色，氣生菌絲呈乳白色且較為發達，無可溶性色素產生，該菌株的菌落形態具有高溫放線菌培養的典型特征。高溫放線菌FBKL4.014的微觀形態特征如圖1B所示，結合《伯杰氏細菌鑒定手冊》分析，發現其菌絲體較短，形狀不一且黏在一起呈簇狀，呈圓球形的分生孢子直接著生于菌絲體上，分布于菌絲體兩側，其中有分支的孢子梗長度較短。
1.2 菌株的最適生長溫度
實驗結果表明，菌株FBKL4.014在45～50 ℃條件下生長最旺盛，在55～60 ℃高溫范圍內仍能夠緩慢生長，37 ℃時該菌株能正常生長，但在30 ℃時不生長。Wang Xueshan等和顏林春的研究表明高溫放線菌屬大多可以生長在最高溫度可達60～65 ℃的高溫發酵環境中，因此，菌株FBKL4.014在耐熱性方面與高溫放線菌具有很高的相似度，而這也與其分離環境——醬香大曲的高溫發酵環境密切相關。
1.3 菌株的生理生化特征
生理生化分析表明，高溫放線菌FBKL4.014為革蘭氏陽性菌，該菌株可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，并能使牛奶凝固但不胨化，使明膠產生液化現象，同時該菌株能水解淀粉和纖維素，由此推測該菌株能夠代謝產生淀粉酶和纖維素酶，具備將大分子原料降解為可發酵性糖的潛能，有助于推動整個釀造過程的順利進行。碳源利用實驗結果顯示，該菌株能夠有效利用葡萄糖、海藻糖、D-棉子糖、D-甘露醇和D-山梨醇等碳源進行生長代謝，對麥芽糖表現出弱利用特征，不能利用乳糖和肌醇兩種碳源。此外，該菌株能夠利用硫酸銨和磷酸氫二銨兩種無機氮源和酪氨酸，對尿素表現出弱利用性，不能利用脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酸和甘氨酸。
1.4 菌株16S rRNA基因系統發育分析
高溫放線菌FBKL4.014基因組DNA片段長度約23 kb，經PCR擴增、拼接后的16S rDNA序列有效片段長度約為900 bp，與GenBank、EzTaxon等數據庫中相似菌株的16S rDNA序列進行比對分析，并在種分類學水平搜索序列相似性，結果顯示菌株FBKL4.014與萊斯氏屬下糖萊斯氏菌（Laceyella sacchari）序列相似性最高；通過構建系統發育樹，發現高溫放線菌FBKL4.014與L. sacchari JF819833聚類在同一個分支上，其序列同源性為99.78%，因此判斷該菌株在種水平上極有可能為L. sacchari。
2 L.sacchari FBKL4.014全基因組結果分析
2.1 菌株FBKL4.014基因組的一般特征
L. sacchari FBKL4.014基因組信息已上傳NCBI GenBank數據庫中，登錄號為CP103866.1。對Illumina NovaSeq和PacBio Sequel下機測序數據進行聯合拼裝，得到完整的基因組序列。L. sacchari FBKL4.014基因組序列全長3.35 Mb，GC含量為48.67%，共預測到3 328 個蛋白編碼基因，包括97 個tRNA、31 個rRNA（10 個5S rRNA、11 個16S rRNA、10 個23S rRNA）和36 個ncRNA編碼基因，預測到11 條CRISPRs結構，測序深度為433×。利用CGView軟件繪制了FBKL4.014基因組圈圖。此外，通過NCBI平臺查閱到其他糖萊西氏菌的GC含量大多在47%～49%之間，與本研究菌株所測得的GC含量（48.67%）接近，進一步證實該菌符合高溫放線菌菌屬GC含量低的特征。
2.2 菌株FBKL4.014基因組功能注釋結果
利用BLAST在線比對分析工具將FBKL4.014的測序結果分別與NR、直系同源蛋白分組比對（eggNOG）、KEGG、Swiss-Prot、GO和Pfam數據庫進行比對分析，獲取注釋到的蛋白編碼基因數量分別為3 325、2 580、1 649、2 301、2 150 個和2 497 個；其中，在TCDB和PHI數據庫中注釋到的基因數較少，分別為474 個和553 個。此外，在CAZy和CARD數據庫中分別注釋到72 條和56 條基因信息。
2.3 eggNOG（COG）數據庫基因注釋分析
eggNOG（COG）數據庫的比對分析結果顯示， 在 數 據 庫 的 所 有2 5 個 功 能 分 類中， FBKL4.014共有19 類2 580 個基因得到了注釋，占注釋基因總數的77.52%。其中具有潛在生物學功能的基因注釋結果最為豐富，共721 個，占注釋基因總數的27.95%，這也為今后針對高溫放線菌未知基因組信息的進一步挖掘提供可能。其次，氨基酸轉運與代謝存在215 個注釋結果，占注釋基因總數8.33%；有研究表明醬香大曲中氨基酸代謝的活躍程度總體較高，釀酒原料中含有豐富的蛋白質，微生物通過氨基酸代謝、轉運途徑分解原料中的蛋白質，不僅可以為微生物生長提供必須的能量物質，也可以為酒體提供風味及其前體物。結合課題組前期的工作，這一研究結果的發現也說明在發酵體系中菌株FBKL4.014可能與醬香型白酒中含氮化合物的形成密切相關。
2.4 GO數據庫基因注釋分析
GO數據庫的比對結果表明，菌株基因組共有2 150 個蛋白編碼基因得到注釋，占注釋基因總數的64.60%。在GO數據庫生物過程、細胞組成、分子功能三大功能分類數據庫中，生物過程、細胞氮化合物代謝過程、生物合成過程和小分子代謝過程這4 個途徑富集的基因數量最多，分別富集到2 030、789、753 個和579 個基因。有研究表明，在醬香型白酒高溫釀造體系下，隨著發酵溫度升高，大曲中微生物豐度隨之降低，因此以菌株FBKL4.014為代表的一類嗜熱菌的正常生物合成和代謝活動對推動醬香型白酒整體釀造進程意義重大，尤其是細胞氮復合代謝過程富集到較多的基因，也與前期該菌株能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽以及利用硫酸銨和磷酸氫二銨等無機氮源的研究結果高度相關，初步揭示該菌株具有將無機氮轉化為如游離氨等某些含氮風味物質前體物的潛力。碳水化合物代謝過程和分解代謝過程也分別富集了113 個和272 個基因，表明該菌株可能參與到釀酒原料中淀粉、纖維素及其他有機大分子物質的分解代謝過程，是酒體中風味及其前體物的潛在來源。此外，細胞、細胞組成、細胞內和細胞質4 個途徑分別富集到686、523、510 個和396 個基因；分子功能、離子結合和DNA結合3 個途徑也分別富集到1968、690 個和336 個基因。
2.5 KEGG數據庫注釋分析
KEGG數據庫中FBKL4.014共有1 649 個蛋白編碼基因注釋到8 個層級的205 條通路中，占基因總數的49.55%。分析結果表明代謝途徑富集到的基因數量最多，共1 085 個，其中有19 個較為完整的代謝途徑，總體上表現出氨基酸代謝活動較為活躍的結果。
進一步通過KEGG數據庫氨基酸代謝通路分析，發現菌株具備丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸、色氨酸和蘇氨酸等19 種氨基酸代謝途徑。對氨基酸代謝通路的進一步分析發現，天冬氨酸、絲氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酸和天冬酰胺可由糖類物質生物轉化而成，丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸既可以由糖類物質生物合成，也可以由前述的6 種氨基酸通過生物轉化合成。從FBKL4.014注釋結果發現、亮氨酸、精氨酸、賴氨酸和酪氨酸只能通過相應氨基酸生物轉化而不能由糖類物質合成，這與張巧玲等的研究結果一致。氨基酸代謝在白酒釀造體系中極為重要，主要表現在3 個方面：一方面氨基酸是醬香型白酒中風味前體物的重要來源，可代謝產生相應的醇類物質作為酒體中酸類和酯類物質形成的重要前體，如亮氨酸代謝生成異戊醇、異亮氨酸代謝產生活性戊醇、酪氨酸代謝產生酪醇、纈氨酸代謝產生異丁醇、苯丙氨酸代謝產生2-苯乙醇等。另一方面氨基酸本身就是醬香型白酒中風味物質的直接來源，通過代謝產生內酯、大馬士酮和香葉基內酮等風味物質。第三氨基酸與還原糖在高溫條件下發生美拉德反應生成呋喃類衍生物、吡咯類衍生物和醛酮及吡嗪類衍生物。因此，菌株FBKL4.014 KEGG注釋分析結果也初步表明其在醬酒釀造體系中可能與一些含氮風味組分的產生密切關聯。
FBKL4.014基因組中GH15家族的葡萄糖淀粉酶（EC 3.2.1.3）是水解淀粉的主要酶，在白酒釀造中可將原料中的淀粉水解為葡萄糖，一方面葡萄糖為酵母菌、細菌等微生物生長代謝提供營養物質和能量，推動發酵過程的進行；另一方面葡萄糖經糖酵解、三羧酸循環、丙酮酸代謝等途徑產生氨基酸、有機酸等酒體風味及風味前體物。此外，GH3家族的β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）是纖維素降解的關鍵酶，通過水解纖維素非還原末端β-D-糖苷鍵形成葡萄糖。這也進一步證實了前期菌株生理生化特征有關菌株能產淀粉酶和纖維素酶的推測。總之，從CAZy分析角度對菌株FBKL4.014降解淀粉、纖維素等碳水化合物能力的明確，再次表明高溫放線菌類群在推動醬香型白酒釀造順利進行的過程中具有一定的潛在作用。
2.6 FBKL4.014四甲基吡嗪合成相關基因分析
白酒釀造體系中的四甲基吡嗪可通過微生物代謝產生，乙偶姻和游離氨是其關鍵前體物。因此四甲基吡嗪的代謝可分為兩部分：1）吡嗪半環碳骨架化合物的合成；2）吡嗪含氮基團結構的形成。一方面，釀酒原料中的糖類物質在微生物作用下，經糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）途徑產生丙酮酸，丙酮酸通過乙酰乳酸合酶（EC 2.2.1.6）轉化為α-乙酰乳酸，隨后通過乙酰乳酸脫羧酶（acetolactate decarboxylase，ALDC）脫羧轉化為乙偶姻（半環碳骨架化合物）；另一方面，蛋白質被蛋白酶水解成游離氨基酸，經氨基酸代謝進一步轉化為游離態氨（含氮基團）；半環碳骨架化合物和含氮基團通過非酶促反應生成四甲基吡嗪。
3 結論
從醬香型高溫大曲中篩選到1 株高溫放線菌FBKL4.014，經形態學、生理生化特征、16S rRNA基因系統發育樹鑒定，確定其可能為高溫放線菌科、萊斯氏菌屬下的L. sacchari。同時，利用第2代和第3代結合的測序技術完成L. sacchari FBKL4.014基因組測序工作，測序結果表明，L. sacchari FBKL4.014染色體基因組序列全長3.35 Mb，GC含量48.67%，測序深度433×，共預測到3 328 個蛋白編碼基因，為后續進一步對其進行功能性研究提供數據支持，同時希望為醬香型白酒釀造體系中其他未培養微生物篩選方法提供參考。
通過全基因組測序及基因組解析，發現了L. sacchari FBKL4.014基因組上葡萄糖淀粉酶（EC 3.2.1.3）、β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）等碳水化合物活性酶編碼基因的存在，證實其可能為該菌株參與釀酒原料中碳水化合物分解代謝的關鍵證據。KEGG數據庫注釋分析結果進一步顯示該菌株基因組中有較完整的氨基酸代謝途徑，說明該菌株氨基酸代謝活動也可能非常活躍；醬香型白酒中含氮化合物高是其典型的風格特征，其中，細胞氮復合代謝過程可能是該菌株將環境中的無機氮轉化為某些風味前體物的關鍵途徑，無疑表明菌株FBKL4.014很可能也是醬香型白酒中含氮物質的重要微生物來源。此外，該菌株基因組中還存在四甲基吡嗪合成的關鍵酶編碼基因，同時針對ALDC和2,3-BDH尚未在該菌株基因組中被發現的事實，推測該菌株可能存在尚未被發現的特殊的四甲基吡嗪生物合成完整途徑，也為今后醬香型白酒中風味組分在高溫放線菌中的生成機理研究提供了基因層面的數據支持。本研究有助于發掘醬香大曲中高溫放線菌的功能應用價值，為后續高溫放線菌功能特性的確定與資源挖掘奠定了基礎。
