基于六偏磷酸鈉復合水凝膠包埋體系的構建及作用機理

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）可以平衡腸道微生物菌群，提高免疫功能，但由于植物乳桿菌在食品制造、運輸、儲存及人體胃腸道消化過程中會遇到環境壓力，如高溫、鹽、氧氣及胃液和膽鹽等因素的影響，從而降低生物利用度，限制其功能特性的發揮。水凝膠是由一種或多種天然或合成聚合物組成，能夠保護益生菌免受其在食品加工過程中惡劣條件的影響，同時凝膠基質可以抵抗載體在胃腸道發生化學和酶降解，并有效地在結腸中釋放其負載的生物成分，是目前研究中發現的一項較好的益生菌保護機制。明膠（GE）是由膠原蛋白部分水解而來，是一種常用的蛋白質類水凝膠。

因此，河南科技大學食品與生物工程學院研究團隊通過六偏磷酸鈉（SHMP）對GE進行修飾構建初級網絡水凝膠，加入植物乳桿菌后利用谷氨酰胺轉氨酶（TGase）進一步修飾GE/SHMP，使其更有利于植物乳桿菌遞送，以GE、GE/SHMP水凝膠及包埋體作為對照，利用物理和化學分析方法對水凝膠復合體系的結構及性能進行分析，探討GE/SHMP/TGase的作用機理及包埋植物乳桿菌后對水凝膠性能的影響，以期為益生菌功能性食品的開發及貯藏提供理論依據。

1 處理方式對復合水凝膠包埋體凝膠強度影響

通常情況下，凝膠強度受氨基酸含量、分子質量分布和提取過程的影響。SHMP和TGase修飾的GE復合體的強度高于單一經SHMP修飾的GE，說明經TGase修飾后能顯著增加GE的凝膠強度。雖然向體系中加入植物乳桿菌后可能會干擾凝膠基質中GE/SHMP或TGase分子的相互作用，導致凝膠網絡不均勻，水凝膠的凝膠強度降低，但結果表明GE/SHMP/TGase復合水凝膠的膠強度顯著高于GE/SHMP復合水凝膠及單一的GE水凝膠（P＜0.05），說明GE/SHMP/TGase復合水凝膠包埋體的分子間作用力較強，有利于包埋的植物乳桿菌的抵抗不良環境的影響。

2 復合水凝膠包埋體膠凝動力學分析

在最初0.5 h內所有凝膠體系的G’和損耗模量G”都以較快的速率增長，G’和G”在某一點（即凝膠點）相交后G’變得高于G”，這表明在冷卻過程中形成了凝膠膠體。由于凝膠化過程是GE分子從無規卷曲變成三螺旋的過程，膠體網絡結構形成后，G’隨著時間的推移以較小的速率增加，表明GE及復合物繼續形成三螺旋結構，進一步增強凝膠網絡結構。對凝膠動力學方程進行分析，可以發現所有復合凝膠體系的G’和G”隨著時間的延長凝膠G’在95%的置信區間內具有典型的一致變化。對圖2B、D、F分析可知當加入植物乳桿菌后會減少分子之間的物理相互作用或共價交聯鍵的數量，凝膠G’損失，從而影響凝膠網絡連接，導致加菌后凝膠形成的速率比未加菌凝膠形成速率低。對比圖2A、C、E可知，經改性后復合凝膠形成速率顯著低于單一GE的膠凝速率，這是因為TGase催化GE產生空間效應從而形成了含有共價鍵的聚合物，該絡合物限制了GE分子鏈的靈活性，從而降低了其凝膠化速率。

3 復合水凝膠包埋體水分分布狀態分析

經復合水凝膠對應的水的特征是在0.01～1 ms（T21）范圍內具有最小的流動性；在1～100 ms（T22）范圍內出現了一個很小的弱峰，表示水凝膠網絡中的水流動性較差；在100～10000 ms（T23）范圍內相應的信號強度遠低于游離水，說明游離水位于交聯網絡之外，具有優異的流動性。而較短的初始弛豫時間T2對應于水與基質之間結合更加緊密，水的流動分數更小，水凝膠樣品的自由度和遷移率較低，凝膠網絡結構致密，另外從圖3可以發現，經SHMP和TGase修飾后水凝膠樣品各峰面積所占比例高于GE，這可能是因為磷酸化過程中引入了負電荷，在GE分子鏈中引入磷酸基團可以增強磷酸基團與GE中氨基酸的NH3+之間的離子相互作用，導致蛋白質的聚集，進一步限制了水分子的流動。表明GE/SHMP/TGase復合水凝膠包埋體相對于單一的GE基水凝膠，體系對水的結合能力得到了極大的改善，能將水分子牢固地保留在凝膠網絡中，進而可以提升凝膠的pH值響應能力，調節植物乳桿菌在模擬胃液中的釋放行為。

4 復合水凝膠包埋體的穩定性分析

對于GE，Td通常指的是螺旋-螺旋轉變溫度，Td值主要與GE分子鏈之間的非共價相互作用和三螺旋樣結構的數量有關，它代表三螺旋結構中氫鍵的斷裂和無規則螺旋的形成，反映了GE體系中三螺旋狀結構的穩定性。GE/SHMP/TGase復合水凝膠的熱變性溫度高于GE/SHMP高于GE，說明GE經SHMP及TGase修飾后熱變性溫度提高，這是因為GE三螺旋和最終網絡結構的主要能量來源于GE鏈之間形成的氫鍵或疏水相互作用，而這種相互作用是非共價結合，形成的穩定性差、對熱敏感，而GE/SHMP是通過離子之間的靜電相互作用而交聯在一起，因此需要更多的熱量才能破壞其穩定性，酶交聯后蛋白側鏈上特定基團交聯形成了更大的分子，產生了大量的高能異肽共價鍵，從而使產物的熱穩定性進一步提高，表明TGase的存在提高了該復合包埋體系的化學穩定性。

5 復合凝膠結構特征分析

5.1 復合凝膠形成過程中三級結構的變化

磷酸化GE的熒光強度高于單一GE，可能是由于磷酸化使GE的芳香基團暴露從而使其三級構象發生改變，蛋白質展開，可以推測磷酸化促使GE的芳香族氨基酸暴露在水中并與蛋白質分子表面的磷酸化基團發生反應。在磷酸化預處理后TGase介導交聯，觀察到發射波長最大值藍移（527.01～525.97 nm），表明蛋白質中的氨基酸經過磷酸化預處理后TGase介導交聯改變了GE的氨基酸微環境的極性。當植物乳桿菌被添加到凝膠中時，GE分子之間的氫鍵和靜電相互作用減少，從而將疏水基團驅逐到表面，對于單一含有植物乳桿菌的GE，植物乳桿菌的存在導致凝膠的熒光強度降低，并伴有輕微的紅移，這表明這些蛋白質將其含色氨酸的延伸區暴露于極性更大的環境（水相），植物乳桿菌產生強烈的空間位阻效應，從而阻斷色氨酸殘基的熒光信號，并因此導致熒光強度下降。

5.2 復合凝膠形成過程中二級結構的變化

磷酸化GE的FTIR光譜圖如圖6所示。通常酰胺A與分子內氫鍵偶合的—NH伸縮振動有關，對于GE酰胺A的吸收峰出現在3420 cm-1附近，GE/SHMP與GE/SHMP/TGase酰胺A的吸收峰分別出現在3408 cm-1和3356 cm-1處，GE/SHMP/TGase有明顯的紅移，這可能是由于GE中的—COOH、—OH基團和—NH殘基之間形成了更多的氫鍵。在2360 cm-1處發生了明顯的變化這是二氧化碳呼吸峰造成。磷酸化GE酰胺I帶的變化歸因于C＝O伸縮振動，該伸縮振動與CCN變形、CN伸縮和NH平面內彎曲模的貢獻相偶合，分別在1666 cm-1（GE/SHMP）和1668 cm-1（GE/SHMP/TGase）附近，而GE的酰胺I帶約為1646 cm-1，與未磷酸化GE的結果相比磷酸化后發生明顯藍移，這可能是由于引入磷酸基團產生的靜電相互作用。從圖6可以看出，GE在1244 cm-1處僅有一個很弱的吸收峰，這表明GE鏈中引入了磷酸基團，可以推斷磷酸化GE中可能形成C—N—P鍵。在707～1082 cm-1范圍內的吸收帶對應于C—C和C—O—C骨架的對稱伸縮振動，GE在該范圍內具有很多較小的弱峰，而GE/SHMP與GE/SHMP/TGase在該處的峰增強，峰位變尖，說明在該處碳鏈骨架增長，進一步證實了GE/SHMP/TGase水凝膠通過非共價鍵及共價鍵結合形成了致密的凝膠網絡結構，有利于植物乳桿菌的包埋。

5.3 復合凝膠微觀結構分析

所有凝膠樣品均呈蜂窩狀網絡結構，與典型的GE網絡結構一致。添加TGase后水凝膠的微觀結構更加有序和穩定，水凝膠中出現層狀結構和多孔結構的組合，但GE/SHMP/TGase水凝膠的孔徑遠小于GE/SHMP的水凝膠，使其更適合益生菌的遞送系統。嵌入益生菌的水凝膠的微觀結構與不含益生菌的水凝膠相似，但前者略顯不規則。

5.4 圖解模型

建立關于SHMP與TGase增加GE功能特性的模式圖。蛋白質的天冬氨酸基（β-羧基）、蘇氨酸基、絲氨基和酪氨酸殘基上的氧與磷酸基團相連，形成了非共價鍵，引入的磷酸基團可以與水分子形成大量的氫鍵，促進了凝膠網絡的形，加入植物乳桿菌后，其通過氫鍵和疏水相互作用嵌入GE/SHMP復合水凝膠中。由于引入的磷酸基團增加了蛋白質體系的電負性，磷酸化預處理后導致GE的分子結構發生變化，暴露出更多的TGase作用位點。TGase靶向交聯谷氨酰胺的γ-COOH和賴氨酸的ε-NH2，形成了共價鍵。TGase的進一步交聯導致小分子質量聚合物消失，通過蛋白質分子內部和蛋白質分子之間的共價和非共價交聯，增加了大分子質量蛋白質聚合物的形成和含量。

6 植物乳桿菌在模擬胃液腸液中的存活性及釋放性分析

所有類型水凝膠包埋的植物乳桿菌細胞活菌數在9.48～9.59（lg（CFU/mL））。經模擬胃液消化后GE/SHMP/TGase、GE/SHMP、GE水凝膠中植物乳桿菌存活率相對于初始活菌數分別為89.5%、62.3%、57.02%。這些結果表明將植物乳桿菌包裹在GE/SHMP/TGase水凝膠中可以最大限度保護植物乳桿菌活菌數免受胃液中不利條件的影響。GE/SHMP/TGase水凝膠中植物乳桿菌活菌數的提高是因為其致密的網狀結構可以抑制胃酶滲透到凝膠網絡中。此外，由于其具有較高的凝膠強度，分子間的相互作用力強，從而降低胃酸和胃蛋白酶向水凝膠中的擴散速率。水凝膠經模擬腸液處理2 h后，所有類型的水凝膠中植物乳桿菌活細胞數均減少，但其下降速率顯著低于在胃液中的活細胞數，說明大多數植物乳桿菌死亡發生在模擬胃液處理期間，這可能是由于植物乳桿菌對胃酸的耐受性相對較低所致。單一GE凝膠網絡結構較差對植物乳桿菌的保護性低，導致其在模擬胃液消化后代謝活性降低，經模擬腸液處理后下降了4 個對數周期，而復合水凝膠基質中在模擬腸液中僅下降了1 個對數周期，這可能是復合水凝膠中的凝膠網絡可以通過減緩低酸性環境對植物乳桿菌的代謝活性造成影響，從而對其起到一定的保護作用。

不同復合材料的累計釋放速率不同，單一GE中植物乳桿菌的釋放速率在前30 min內迅速增加，然后在其余時間緩慢增加，之后保持不變，GE/SHMP水凝膠在0～60 min內觀察到較低的釋放率，在消化60 min后也顯示出突然釋放，表明凝膠結構的形成能夠延緩其在模擬胃液階段的釋放。復合水凝膠的累計釋放量為66.2%略高于GE/SHMP（44.6%）和GE（37.0%），在模擬胃液中GE/SHMP/TGase釋放速率最慢，而在模擬腸液中的釋放速率變快。造成上述差異的原因由很多因素決定，包括活性成分的性質、水凝膠的結構和大小、聚合物的性質以及聚合物基質的相互作用。GE/SHMP/TGase不僅對植物乳桿菌的控釋具有協同作用，還有助于增加模擬腸液消化后的累積釋放。

7 復合凝膠包埋體貯藏穩定性分析

水凝膠中的植物乳桿菌在4 ℃定期監測28 d期間其穩定性，在貯存期間具GE/SHMP/TGase水凝膠中植物乳桿菌的活菌數沒有明顯變化，但對于其他水凝膠，植物乳桿菌的存活率趨于降低。這可能是因為GE/SHMP/TGase具有致密的網狀結構和厚壁的蜂窩狀微觀結構而表現出最佳保水能力，有效減少了水凝膠脫水收縮導致的益生菌損失。

8 結論

本研究主要以GE/SHMP/TGase制備復合水凝膠包埋體，以GE、GE/SHMP水凝膠及包埋體作為對照，通過對水凝膠及包埋體的流變特性、凝膠強度、水分遷移狀況、熱穩定性、微觀結構、FTIR光譜及熒光光譜進行測定，研究GE/SHMP/TGase的作用機理及對植物乳桿菌的包埋效果。通過對凝膠體系的流變性能、熱穩定性及微觀結構進行分析發現GE/SHMP/TGase復合水凝膠的凝膠形成速率較低，酶交聯后蛋白側鏈特定基團交聯形成了更大的分子，產生了大量的高能異肽共價鍵，導致其熱穩定性增加，形成了更加穩定的三維網絡結構，有利于植物乳桿菌的長期穩定的存在。低場核磁共振分析表明GE/SHMP/TGase具有更好的保水作用，SHMP和TGase的引入可以改變體系對水的結合能力，促進凝膠形成更加致密的空間網絡狀結構，進而可以提升殼層凝膠的pH值響應能力，調節包埋物質在SCF中的釋放行為。

模擬胃腸道消化實驗表明，經模擬胃液和模擬腸液消化后，GE/SHMP/TGase水凝膠包埋的植物乳桿菌的存活率顯著高于單一GE基水凝膠。貯藏實驗結果表明GE/SHMP/TGase水凝膠包埋的植物乳桿菌的儲存穩定性（28 d內）較好。進一步證實該復合水凝膠包埋體具有較高的穩定性、流變特性、保水性及凝膠網絡結構特性等性能。因此，利用GE/SHMP/TGase復合水凝膠包埋植物乳桿菌，可以有效提升植物乳桿菌的在胃腸道等不利因素下的存活性，為益生菌產品的開發提供有益參考。