傳代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)（基本方法一）
原理
當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時間的延長和細(xì)胞不斷分裂，一方面細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)物不足和代謝物積累不利于細(xì)胞生長甚至發(fā)生中毒，如果不及時的減少細(xì)胞密度，細(xì)胞將逐漸衰老死亡。因此需要將培養(yǎng)物按照比例重新接種到新的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，這個過程就稱為傳代培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化把細(xì)胞分散成單細(xì)胞再傳代，而懸浮型生長細(xì)胞的傳代則用直接傳代法或離心法傳代。細(xì)胞種類不同，所需的培養(yǎng)基、添加劑以及傳代培養(yǎng)的操作都會有所不同，可以參照 ATCC（美國模式培養(yǎng)物集存庫．http://www.atcc. org）網(wǎng)站上列出的相關(guān)信息來操作細(xì)胞。
材料與儀器
試劑：細(xì)胞 Hanks、胰蛋白酶 EDTA
儀器：培養(yǎng)液吸管、培養(yǎng)瓶
步驟
一、貼壁細(xì)胞：HeLa 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
1. 選取生長密度 80% 左右的 HeLa 細(xì)胞，在生物安全柜中操作，吸去培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)基，加入 2 mL 的 D-Hanks 溶液，漂洗細(xì)胞以除去殘留的血清。
2. 吸去培養(yǎng)皿中的 D-Hanks 溶液，加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶消化液，于 37 ℃ 消化 2～3 min（如消化程度不夠，可延長時間)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)大部分細(xì)胞變圓時，輕輕吸去酶消化液（如果有較多細(xì)胞漂起，需要直接加入完全培養(yǎng)基來終止胰蛋白酶的消化反應(yīng)）。
3. 加入 4 mL 完全培養(yǎng)基，用移液管反復(fù)吹打細(xì)胞成為細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到 15 mL 離心管中，1000 rpm 離心 5 min。
4. 輕輕吸去上清后用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，把細(xì)胞懸液一分為二或者一分為三后分別轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中。
5. 接種好的細(xì)胞，應(yīng)在培養(yǎng)皿上標(biāo)記上細(xì)胞名稱、本次傳代日期和操作人，輕輕搖勻后轉(zhuǎn)移到 CO2 培養(yǎng)箱中于 37 ℃ 培養(yǎng)。
6. 細(xì)胞培養(yǎng) 24 h 后，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色及細(xì)胞的生長密度進(jìn)行相應(yīng)的操作（更換新鮮培養(yǎng)基或者再次傳代處理）。
二、懸浮細(xì)胞或半貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：
懸浮細(xì)胞不貼壁（半貼壁細(xì)胞貼壁不緊），所以不需要借助胰蛋白酶消化，具體過程如下：
1. 取狀態(tài)良好的細(xì)胞，在生物安全柜中操作，用移液管把細(xì)胞吹打均勻。
2. 把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到 15 mL 離心管中，1000 rpm 離心 5 min。
3. 輕輕吸去上清后用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，把細(xì)胞懸液一分為二或者一分為三后分別轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中。
4. 接種好的細(xì)胞，應(yīng)在培養(yǎng)皿上標(biāo)記上細(xì)胞名稱、本次傳代日期和操作人．輕輕搖勻后轉(zhuǎn)移到 CO2 培養(yǎng)箱中于 37 ℃ 培養(yǎng)。
5. 細(xì)胞培養(yǎng) 24 h 后，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色及細(xì)胞的生長密度進(jìn)行相應(yīng)的操作（更換新鮮培養(yǎng)基或者再次傳代處理）。
注意事項(xiàng)
1. 把握發(fā)了傳代時機(jī)，已如前述，在 80%~90% 匯合階段最好，過早傳代細(xì)胞產(chǎn)量少，過晚細(xì)胞健康狀態(tài)不佳。
2. 消化時間要適度，過短細(xì)胞不易從瓶壁脫落，過長細(xì)胞可脫落流失。
3. 消化液濃度要適宜，過濃時消化作用強(qiáng)烈，細(xì)胞反應(yīng)快，所需消化時間短，掌握不好，細(xì)胞易流失。
4. 各種細(xì)胞對消化反應(yīng)不同，有的敏感，有的遲鈍，因此應(yīng)根據(jù)所用細(xì)胞特點(diǎn)制定適宜消化措施。有的細(xì)胞附著瓶壁不牢，用吸管可從瓶壁直接吹下來，但這樣容易傷害細(xì)胞，細(xì)胞大片脫落掉，不易計數(shù)，應(yīng)盡可能采用消化法分散細(xì)胞為妥。
5. 消化傳代良好時，細(xì)胞受損害少，細(xì)胞懸液均勻，各分裝樣品中數(shù)量誤差小，細(xì)胞生長增殖速度一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性大。
