粗制品的DNA酶足跡分析法

原理

DNA酶足跡分析常用來尋找粗制品中的蛋白質(zhì)，因而提供了一種在純化過程中采用的分析方法。通過改變條件，如在反應(yīng)體系中加入大量的競爭性DNA，或增加反應(yīng)中鹽的濃度，可抑制非特異性的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合到標(biāo)記的DNA上。

材料與儀器

含有DNA結(jié)合位點的質(zhì)粒DNA
適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶 100%乙醇及冰冷的70%乙醇 TE緩沖液 [α-32P] dNTP (3000?6000 Ci mmol)水溶液 1O× Klenow片段緩沖液 E. coli DNA聚合酶1的Klenow片段 5 mmol L 4dNTP 混合液 脫氧核糖核酸酶I (DNA酶I; EC3.L4.5) 分析緩沖液A或B 干冰 DNA酶I終止緩沖液 DNA酶I儲存緩沖液 甲酰胺加樣緩沖液
10 mL 一次性塑料管 硅烷化1.5 mL微量離心管 可調(diào)節(jié)水浴鍋（±0. 1℃) 12 in×7.5 in大小的玻璃或不銹鋼碟 有蓋子的塑料微量離心管 6 mm寬間隔12 mm的DNA測序膠梳 平頭Hamilton注射器（29-G 用于0.4 mm膠）

步驟

1) 同基本方案中的步驟1?7制備32P單末端標(biāo)記的DNA。

2) 從各稀釋度中找出能產(chǎn)生約50%無切口 DNA (0. 1 mg/mL)的DNA酶I濃度。建 立一個200μL的包括探針和分析緩沖液的反應(yīng)體系，但不加蛋白質(zhì)，如基本方案的步驟10。加入5μL稀釋的DNA酶I，輕輕混合，稍加離心。

3) 溫育2 min,如基本方案步驟18所述終止反應(yīng)。乙醇沉淀，在測序膠上分析反應(yīng)產(chǎn)物。

4) 按基本方案進行足跡反應(yīng)。不同的是，用恒定體積的、已知具有所需活性的粗組分代替不同量的蛋白質(zhì)。進行一組不同分析條件的實驗來尋找合適的 反應(yīng)條件。