DNA 酶 I 足跡分析實驗（基本方法一）

材料與儀器

含有DNA結(jié)合位點的質(zhì)粒DNA
適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶 100%乙醇及冰冷的70%乙醇 TE緩沖液 [α-32P] dNTP (3000?6000 Ci mmol)水溶液 1O× Klenow片段緩沖液 E. coli DNA聚合酶1的Klenow片段 5 mmol L 4dNTP 混合液 脫氧核糖核酸酶I (DNA酶I; EC3.L4.5) 分析緩沖液A或B 干冰 DNA酶I終止緩沖液 DNA酶I儲存緩沖液 甲酰胺加樣緩沖液
10 mL 一次性塑料管 硅烷化1.5 mL微量離心管 可調(diào)節(jié)水浴鍋（±0. 1℃) 12 in×7.5 in大小的玻璃或不銹鋼碟 有蓋子的塑料微量離心管 6 mm寬間隔12 mm的DNA測序膠梳 平頭Hamilton注射器（29-G 用于0.4 mm膠）

步驟

1）用限制性內(nèi)切核酸酶消化約5 pmol質(zhì)粒，使得在距第1個蛋白質(zhì)結(jié)合位點25?100 bp處產(chǎn)生一個3'凹端

2) DNA用乙醇沉淀，用1 mL冰冷的70%的乙醇洗1次，在Speedvac真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中干燥。DNA沉淀重溶于5μL TE緩沖液中。

3) 加入適當(dāng)?shù)腫α-32P] dNTP水溶液，每種各50μCi，再加入5μL 10× Klenow酶緩沖液，加水至49μL；加1μL Klenow酶（5?10 U），輕輕混合并離心，室溫溫育25 min。

4) 加2μL 5 mmol/L 4dNTP混合液，混勻，溫育5 min。

5) 用離心過柱法除去未摻入的核苷酸。DNA如步驟2—樣用乙醇沉淀。

6) 用第二種限制酶消化，產(chǎn)生僅在一條鏈及一個末端上標(biāo)記的限制性片段，切點位于最遠(yuǎn)離標(biāo)記末端的蛋白質(zhì)結(jié)合位點>150 bp。

7) 用瓊脂糖凝膠電泳，隨后用電洗脫及反相層析法純化含有結(jié)合位點的標(biāo)記DNA。

8) 如步驟2—樣用乙醇沉淀DNA。將DNA溶解于100μL，pH 8.0的TE緩沖液中。在 4℃保存，不要凍結(jié)。

9) 取0.5μL DNA溶液放入水性閃爍液中計數(shù)，以測定DNA的放射性。

10) 在10 mL—次性塑料管中準(zhǔn)備n+2 份180μL分析緩沖液，其中n為實驗中結(jié)合反應(yīng)的份數(shù)。計算達(dá)到10 000?15 000 cpm/泳道的32P標(biāo)記的DNA的體積。加入32P標(biāo)記的DNA，輕輕在渦旋混合器上振蕩混勻。

分析緩沖液的成分（如A或B)取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA系統(tǒng)以及所要解決的問題。DNA酶I的活性需要有微摩爾濃度的Mg2+和Ca2+存在。

11) 將含有32P標(biāo)記的DNA的分析緩沖液按180μL /管分裝入n+1個1.5 mL硅化的微量離心管中，多余的1個管作為不加DNA酶I的對照。

12) 對蛋白質(zhì)進(jìn)行系列稀釋以覆蓋所要分析的濃度范圍。

結(jié)合蛋白的濃度范圍應(yīng)達(dá)到能覆蓋所有蛋白質(zhì)結(jié)合位點飽和度的0?99%，并且應(yīng)以等間隔濃度的對數(shù)值表示，至少要有幾個點用來確定滴定曲線的漸近線

13)根據(jù)需要取2?20μL稀釋的蛋白質(zhì)溶液加入各管中。加分析緩沖液（不含32P標(biāo)記 的DNA)至終體積200μL /管。

14)輕輕混合，稍加離心，在所需溫度的水浴中平衡30?45 min。

15) 準(zhǔn)備過量的DNA酶I終止液（700μL/管），置于干冰/乙醇浴中。

16) 準(zhǔn)備>500μL用無BSA及小牛胸腺DNA的分析緩沖液稀釋的DNA酶I溶液。將它同樣品一起置于調(diào)節(jié)好水溫的水浴中平衡。

17) 準(zhǔn)確吸取5 稀釋的DNA酶I加入第1管樣品中，輕柔且迅速混合，馬上放回水浴中。將定時鐘設(shè)置為2 min。

18) 剛好2 min后，迅速加入700μLDNA酶I終止液。在渦旋混合器上劇烈振蕩混勻，將管置于干冰/乙醇浴中。DNA酶I作用的時間和濃度可作改變（在各次實驗之間，但不要在同一次實驗之中），只要二者的產(chǎn)物（即產(chǎn)生的DNA切口的數(shù)量）保持恒定。作用總時間不成為問題。

19) 每管都重復(fù)步驟17和步驟18的過程。

20) 在步驟11準(zhǔn)備的對照管（不含DNA酶I)中加終止液。

21) 在干冰/乙醇浴中沉淀DNA15 min以上。當(dāng)最后一管放入之后開始計時。

22) 離心15 min,用移液管小心移去上清。加1 mL預(yù)冷的70%乙醇，離心5 min。用移液器小心吸掉上清，因為此時沉淀很松散地接觸在管壁上。重復(fù)洗1次。在 Speedvac真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中干燥沉淀（10?15 min)。

23) 將DNA重懸于5 μL甲酰胺加樣緩沖液中：在試管的內(nèi)表面上方滴出緩沖液，拍打試管使緩沖液沉下。渦旋混合器上劇烈振蕩，離心幾秒鐘。重復(fù)兩次。

24) 如果不馬上進(jìn)行電泳分析，可將樣品保存在-70℃過夜。

25) 制備聚丙烯酰胺DNA測序膠并預(yù)電泳。

26) 在預(yù)電泳時，將樣品置于干熱式電加熱塊中90℃加熱5?10 min,立即浸入冰水中。當(dāng)凝膠溫度達(dá)到50?55℃時，切斷電源，小心加樣，確定吸完所有管中的加樣緩沖液。

27) 電泳至蛋白質(zhì)結(jié)合位點移至膠的中部或略下。用標(biāo)準(zhǔn)方法固定（只對梯度膠）和干膠。

28) 凝膠用經(jīng)預(yù)閃處理的Kodak ×-Omat AR膠片及單塊鎢酸鈣增感屏在-70?-85℃放射自顯影。使膠片預(yù)閃處理過的面對著凝膠。每塊凝膠做2?3張自顯影片（不同的曝光水平）以確保合適的曝光。

29) 在相同的條件下沖洗膠片。

30) 小心保存膠片，膠片之間插入紙片。劃痕、指紋、污垢產(chǎn)生的光學(xué)信號很難與32P區(qū)分。用放射自顯影圖作定量分析。